ESPECTROSCOPIAS

De posse do conjunto amostral de trabalho, composto por 30 amostras variando a concentração dos analitos de 60 a 130% da real (apontada para a amostra AM1), adquiriu-se os espectros para cada uma delas e então obteve-se as concentrações pelo método de referência. Anteriormente à análise quantitativa pelo método de referência, realizou-se a parte espectroscópica pelo fato de se tratar de técnicas não destrutivas.

Foram aplicadas duas diferentes técnicas espectroscópicas por dois principais motivos. O primeiro deles era avaliar o desempenho de cada uma delas no que diz respeito à análise quantitativa, onde se esperava melhor desempenho da técnica de absorção de radiação, no caso o NIR, frente a uma técnica de espalhamento de luz, como o Raman. O segundo ponto interessante é que o Raman, além de possibilitar a informação quantitativa (quando associado a ferramentas quimiométricas), pode fornecer a informação qualitativa de grande qualidade, principalmente para avaliação da modificação da matriz após a diluição ou fortificação, por

Lucas Mattos Duarte Dissertação de Mestrado | UFJF

meio de alguma banda duvidosa que possa aparecer, seja essa oriunda de contaminação ao longo da manipulação da amostra ou possíveis oxidações.

Primeiramente foi feita a aquisição dos espectros raman para os quatro edulcorantes artificiais e para o constituinte majoritário da amostra trabalhada, a lactose. Os espectros para os analitos podem ser vistos na Figura 41.

Figura 41: Espectro FT-Raman para os padrões puros de ACSK, ASP, CIC e SAC

Fonte: ELABORADA PELO PRÓPRIO AUTOR

Como a lactose é o componente majoritário dessa formulação o espectro das amostras de trabalho apresentam um perfil muito similar ao dessa substância o que pode ser percebido

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pela análise da Figura 42, onde é mostrado o conjunto de espectros referentes a todas amostras de trabalho (a) e o espectro que diz respeito à lactose (b); os espectros para cada amostra de trabalho foram adquiridos no mesmo dia para que houvesse o mínimo de variação instrumental. A diferença mais perceptível entre as duas figuras aparece na região compreendida entre 1550 e 1750 cm-1, onde a lactose não apresenta bandas, enquanto que para o conjunto de amostras é possível observar duas. A primeira, com máximo de intensidade em 1580 cm-1 pode-se referir aos estiramentos simétricos 𝐶 = 𝐶, presentes nas estruturas do ASP, SAC e ACSK, já a segunda, em 1700 cm-1, refere-se ao estiramento simétrico da carbonila (𝐶 = 𝑂), que pode estar associados também aos analitos ASP, SAC e ACSK.

Figura 42: Espectros Raman agrupados para as 30 amostras de trabalho (a) e espectro Raman para a lactose (b)

Fonte: ELABORADA PELO PRÓPRIO AUTOR

A Figura 42 (a) dá a impressão de que para as 30 amostras existe uma grande similaridade nos espectros, no entanto, para aplicação em análises quantitativas é muito

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importante que uma análise mais minuciosa no conjunto de espectros seja feita. Visualmente, é possível perceber que o espectro de uma amostra, destacado em coloração vermelha, aparenta estar em discordância com os demais, o que pode ser melhor visualizado pela aproximação feita na região compreendida entre 2840 e 3000 cm-1(Figura 43). Trata-se da amostra F (ou número 6), na qual os analitos estão com 70% da concentração original, pelo fato desta ter sido diluída. Entretanto, seu espectro apresenta-se com altas intensidades para a maioria das bandas em comparação com os demais espectros e isso seria incoerente, visto que essa é uma amostra diluída. Sendo assim, os espectros das 30 amostras foram submetidos à PCA, para uma melhor classificação do conjunto (Figura 44).

Figura 43: Aproximação feita na região espectral compreendida entre 2840 e 3000 cm-1_{, para melhor} visualização do possível outlier

Fonte: ELABORADA PELO PRÓPRIO AUTOR

Figura 44: PCA para o conjunto de espectros Raman, referente às 30 amostras de trabalho

Fonte: ELABORADA PELO PRÓPRIO AUTOR

Pela PCA mostrada anteriormente percebe-se que as amostra de número 6, ou F, encontra-se distante do principal grupo de amostras e visto que já se desconfiava desta, por ser

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uma potencial outlier, a mesma foi retirada do conjunto e para as modelagens com dados de Raman, foram utilizadas 29 amostras ao invés de 30. Após a retirada dessa amostra, uma nova PCA foi realizada, tornando possível a confirmação de que essa era, de fato, a amostra problema (Figura 45(a)). Na primeira PCA, assim como na segunda, nota-se que por meio de uma PC é possível descrever mais de 99% das variáveis originais, o que ainda tem um ligeiro aumento após a retirada do outlier. Outra forma interessante de olhar, é por meio do gráfico de loadings para a PC1, que descreve perfeitamente o espectro Raman para as amostras de trabalho, dando ênfase nas principais regiões onde existe relevância química e apresentando quase nenhum ruído (Figura 45(b)).

Para o conjunto espectral utilizado, não foi realizado nenhum tipo de pré- processamento, pois as amostras foram todas construídas com sobreposição a uma mesma matriz, os espectros todos adquiridos no mesmo dia (minimizando a variação instrumental) e por tratar-se de uma matriz mais simples, contendo apenas um excipiente. Foram realizados alguns testes para os pré-processamentos, como a aplicação de SNV e MSC, mas o conjunto espectral não apresentou diferenças significativas, logo, optou-se por utilizar os espectros como adquiridos (brutos), a fim de que não houvesse manipulação matemática, o que tornaria os dados ainda mais fiéis à realidade química das amostras.

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Figura 45: PCA para o novo conjunto de espectros Raman, referente as 29 amostras de trabalho (a) e o gráfico de loading mostrando que a primeira PC descreveu 99,61% da variabilidade dos dados

originais (b)

Fonte: ELABORADA PELO PRÓPRIO AUTOR

Os espectros de NIR agrupados para formar o conjunto amostral foram adquiridos na faixa de 4000 a 9000 cm-1, tendo como informação principal os primeiros e segundos sobretons, além de bandas de combinação. Na Figura 46 são mostrados os espectros de NIR agrupados para as 30 amostras referentes ao conjunto de amostras de trabalho. Para esses dados também foi realizada uma PCA, a qual, por meio de essencialmente uma PC, descreveu quase 100% das variáveis originais e mostrou que apesar do conjunto variar ao longo da PC1, não há evidências de outlier (Figura 47). O gráfico de loadings para a PC1 é mostrado na Figura 48.

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Figura 46: Espectros NIR agrupados para as 30 amostras de trabalho

Fonte: ELABORADA PELO PRÓPRIO AUTOR

Figura 47: PCA para o conjunto de espectros NIR, referente as 30 amostras de trabalho

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Figura 48: Espectro médio para as 30 amostras (superior) e gráfico de loadings para a PC1 (inferior), que descreveu 99,98% das variáveis originais

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3.4.4 ADQUIRINDO AS CONCENTRAÇÕES PELO MÉTODO DE REFERÊNCIA: