Espermadesinas e suas funções

influenciada pela variabilidade na composição do plasma, observando-se que a adição de plasma seminal heterólogo pode afetar positiva ou negativamente este parâmetro, dependendo da fonte do plasma seminal. Além das variações entre indivíduos e ejaculados, tem-se demonstrado variações entre frações do plasma seminal dentro de um mesmo ejaculado. Zhu et al. (2000) obtiveram melhor taxa de penetração in vitro, quando os espermatozóides foram incubados com plasma seminal oriundo da fração rica do ejaculado. Posteriormente, Peña et al. (2006) observaram diferentes resistências ao processo de criopreservação, dependendo da fração do ejaculado à qual os espermatozóides pertenciam. Ainda de acordo com os mesmos autores, todas as variações poderiam ser explicadas pelas diferenças nos perfis protéicos, característicos das diferentes frações do ejaculado.

Tem-se observado que a incubação dos espermatozóides com o plasma seminal previne o fenômeno de capacitação espermática (Davis e Niwa, 1974; Kanwar

et al., 1979). Além disso, o processo de capacitação espermática é reversível, podendo ser paralisado pelo contato dos espermatozóides com substâncias estabilizadoras presentes no plasma seminal, capazes de mediar o processo de capacitação (Chang, 1957). Estes fatores decapacitantes devem ser eliminados da superfície da membrana plasmática dos espermatozóides para que seja possível o início da capacitação. Segundo Calvete et al. (1996b), alguns destes fatores pertenceriam, provavelmente, à família das espermadesinas.

Após a ejaculação, um espermatozóide apresenta aproximadamente entre 10 e 60 milhões de moléculas de espermadesinas recobrindo sua superfície. Entretanto, a maioria destas moléculas são eliminadas após o processo de capacitação in vitro (Dostálová et al., 1994). Considerando-se a biossíntese e afinidade das espermadesinas, descreveu-se um modelo no qual os espermatozóides, ainda no epidídimo, apresentariam algumas moléculas de AWN- 1 aderidas à sua membrana plasmática, as quais se uniriam, após a ejaculação, moléculas não agregadas de AWN-1 e AQN-3, que finalmente seriam recobertas pelo resto das espermadesinas na forma de agregados (Dostálová et al., 1995). Esta cobertura de espermadesinas teria a função de prevenir reação acrossômica prematura, sendo a mesma liberada após a capacitação (Töpfer-Petersen e Calvete, 1996; Jansen et al., 2001).

Entretanto, esses agregados de espermadesinas apresentam afinidade pelo colesterol, e podem assim, atuar como receptores dessas moléculas quando liberadas dos espermatozóides. A perda de moléculas de colesterol reduz a proporção colesterol/fosfolipídio, um fenômeno associado à capacitação espermática (Jonáková et al., 2000). Além disso, existe uma afinidade de algumas espermadesinas pela heparina e outros glicosaminoglicanos,

os quais promovem a capacitação espermática e estão presentes na tuba uterina da porca (Therien et al., 1995; Therien et al., 1997; Tienthai et al., 2000). Assim, essas espermadesinas estariam envolvidas na regulação da capacitação, apresentando uma dupla função, já que manteriam as células espermáticas estáveis até sua chegada à tuba uterina, onde promoveriam a sua capacitação. Uma função similar é apresentada pelas proteínas do plasma seminal bovino (BSP), as quais se unem aos fosfolipídios da membrana dos espermatozóides após a ejaculação, estabilizando-a. Contudo, quando são expostos à lipoproteínas de alta densidade e glicosaminoglicanos como a heparina, induzem a capacitação (Therien et al., 1997; Manjunath e Therien, 2002).

A identificação de substâncias do plasma seminal que pudessem estar relacionadas a um efeito benéfico sobre os espermatozóides, foi tentada por Caballero et al. (2006). Neste estudo, avaliaram o efeito protetor do heterodímero PSP-I/PSP- II e sua possível relação com a superfície dos espermatozóides do varrão, submetidos à altas diluições. Para isto, os espermatozóides altamente diluídos foram incubados por 10 horas em um meio salino simples (PBS), na presença ou ausência do heterodímero PSP-I/PSP-II, quando avaliou-se a viabilidade e funcionalidade espermáticas, além de se estudar o padrão de união do heterodímero à cabeça do espermatozóide, mediante técnicas imunocitoquímicas. Demonstrou-se que praticamente 100% dos espermatozóides foram imunopositivos após a adição de PSP-I/PSP-II exógeno, localizando-se o heterodímero, principalmente, na região acrossomal da cabeça do espermatozóide. Entretanto, esta união diminuiu ao longo do tempo de incubação. Assim, observou-se uma redução de até 50% na proporção de espermatozóides marcados pelo anticorpo após 10 horas de incubação, enquanto nas

amostras onde adicionou-se PSP-I/PSP-II exógena, aproximadamente 80% dos espermatozóides permaneceram positivos (p<0,05). Estes dados indicam que o heterodímero se une à membrana do espermatozóide antes ou durante a ejaculação, e que essa união é suficientemente forte para que a proteína permaneça unida por várias horas em uma grande percentagem de espermatozóides, inclusive quando submetidos à diluições extremas.

Com respeito a funcionalidade espermática, Caballero et al. (2006) observaram que a mesma percentagem de espermatozóides que apresentava membrana intacta, apresentava também maior atividade mitocondrial, durante todo o processo de incubação; no entanto, a percentagem de espermatozóides móveis foi sempre menor que a de espermatozóides com membrana intacta. As diferenças encontradas nesse estudo entre a motilidade e a atividade mitocondrial, já foram descritas anteriormente, e refletem, provavelmente, diferenças na atividade espermática ou na metodologia empregada (Windsor, 1997; Centurión et al., 2003). Entretanto, hipotetiza-se que a função das mitocôndrias seria fornecer ATP para a cabeça do espermatozóide e peça intermediária por fosforilação oxidativa, visando manter ativos os diferentes gradientes de difusão da membrana plasmática, imprescindíveis à sobrevivência espermática. Dentro desse contexto, o ATP necessário para a motilidade espermática seria produzido mediante a glicólise (produção anaeróbica de ATP) por enzimas localizadas na bainha fibrosa da cauda dos espermatozóides (Silva e Gadella, 2006).

Ao estudarem o efeito in vitro das subunidades PSP-I e PSP-II sobre as características funcionais dos espermatozóides altamente diluídos, Garcia et al. (2006) observaram que a sub-unidade

PSP-II parece imitar o efeito descrito para o heterodímero (Centurión et al., 2003) já que mantém a viabilidade, motilidade e atividade mitocondrial dos espermatozóides ao longo do tempo. Assim, ainda que a sub- unidade PSP-I também exerça um efeito protetor sobre a viabilidade e atividade mitocondrial do espermatozóide, esta é de menor intensidade quando comparado ao exercido pela sub-unidade PSP-II. Contudo, deve-se destacar que a sub-unidade PSP-I exerce um efeito prejudicial sobre a motilidade espermática, seguindo um padrão muito similar ao que se observou previamente in vitro para as espermadesinas que se unem à heparina (HBPs) (Centurión et al., 2003). Essas proteínas produziram uma clara imobilização de espermatozóides submetidos a altas diluições, quando incubados na presença de HBPs (Centurión et al., 2003). Entretanto, de acordo com Garcia et al. (2006) a observação de que a sub-unidade PSP-I suprime a motilidade espermática, o que não ocorre com o heterodímero total, sugere que esta atividade poderia estar suprimida pela dimerização, produzida quando da união das duas sub-unidades para formar o heterodímero PSP-I/PSP-II.

Alguns estudos têm estabelecido que as HBPs exerçam um efeito nocivo sobre a fisiologia espermática in vitro. As espermadesinas PSP-I/PSP-II exercem, por outro lado, um efeito contrário. Assim, a reunião de ambos os tipos de espermadesinas provocam efeitos intermediários sobre espermatozóides altamente diluídos (Centurión et al., 2003). Sendo assim, a variabilidade entre as concentrações relativas de ambas as proteínas do plasma seminal poderia responder pelas diferentes respostas dos espermatozóides quando diluídos no plasma seminal, já que são as proteínas mais abundantes no mesmo. Desta forma, Garcia et al. (2009) realizaram coletas do ejaculado total de três varrões, em séries de 50 mL, para estudar como o perfil protéico das

diferentes frações do ejaculado influenciaria os parâmetros seminais de espermatozóides altamente diluídos. Observaram, ainda, a distribuição do heterodímero PSP-I/PSP-II ao longo dessas frações. Verificou-se que a concentração do heterodímero não foi uniforme entre as frações do ejaculado, nem entre as subfrações em que se dividiu a fração pós-espermática, que apresentou a maior proporção da espermadesina PSP- I/PSP-II, além da maior concentração de proteínas totais. Observou-se, ainda, que a fração rica apresentou a menor concentração protéica. Avaliaram, ainda, o efeito do plasma seminal oriundo das diferentes frações sobre os espermatozóides altamente diluídos, mostrando que a adição de 10% do plasma seminal das distintas frações melhorou a viabilidade e motilidade, quando comparados às dos espermatozóides que haviam sido incubados sem adição do plasma seminal. Contudo, a adição do plasma seminal oriundo da fração rica induziu os melhores resultados de motilidade e integridade da membrana, coincidindo com os resultados obtidos anteriormente, por Peña et al. (2006). Deve-se considerar que a presença do heterodímero PSP-I/PSP-II nessa fração foi baixa. Além disso, observou-se grande quantidade do heterodímero na fração pós- espermática; entretanto, o efeito do plasma seminal dessa fração sobre os espermatozóides altamente diluídos não foram tão benéficos quanto o produzido pelo plasma da fração rica. Assim, estas diferenças poderiam estar relacionadas à concentração da PSP-I/PSP-II presente em cada fração. De acordo com Centurión et al. (2003), o efeito protetor que o heterodímero exerce sobre os espermatozóides altamente diluídos está associado a uma concentração específica da espermadesina, de 1,5 mg/mL, ao passo que concentrações superiores a 7,5 mg/mL provocam, aparentemente, o desaparecimento desse efeito.

Ainda que a fração pós-espermática seja a fração que produz os piores resultados

envolvendo a integridade de membrana e motilidade espermáticas quando comparados aos das outras frações, a sub- fração da fração pós-espermática, caracterizada pela predominância do heterodímero, respondem pelos menores danos sobre as células espermáticas (Garcia et al., 2009). Contudo, de acordo com os mesmos autores, o efeito negativo exercido pelo plasma seminal da fração pós- espermática poderia também estar relacionado à presença das proteínas HBPs, já que sua concentração aumenta paralelamente à do heterodímero PSP- I/PSP-II na fração pós-espermática.

Estes resultados são similares aos apresentados por Centurión et al. (2003), quando observou-se que a incubação de espermatozóides do varrão, submetidos a uma alta diluição, na presença de todas as espermadesinas (PSPs e HBPs), produziu uma queda na funcionalidade espermática devido a presença das HBPs.

2.3.2 Afinidade das espermadesinas