ESQUEMA OPERACIONAL

A fim de avaliar o potencial de uso de resíduos sólidos de citros para obtenção de produtos de interesse biotecnológico, como H2, CH4, AOV e álcoois, foram realizados ensaios fermentativos e ensaios metanogênicos em diferentes condições operacionais.

Primeiramente, foram realizados ensaios fermentativos a fim de comparar diferentes inóculos (autóctones, como o consórcio autofermentativo, e alóctones, como lodos de reator UASB de diferentes origens), diferentes faixas de temperatura (mesofílica, a 37°C, e termofílica, a 55 °C) e, finalmente, duas diferentes formas de pré-tratamento do substrato utilizado (via hidrotermólise, desliginificação alcalina ou in natura). Além disso, realizou-se o isolamento e caracterização de bactérias anaeróbias potencialmente celulolíticas a partir do consórcio autofermentativo.

Após estes ensaios preliminares, onde adotou-se os inóculos, faixa de temperatura e substrato cuja maior obtenção de H2 foi observada, foram realizados novos ensaios fermentativos utilizando o método estatístico de Planejamento Sequencial (Plackett &

Burman e Delineamento Composto Central Rotacional- DCCR). Nos ensaios de Plackett

& Burman, avaliaram-se dez diferentes variáveis operacionais (temperatura, pH, concentração de inóculo autóctone e alóctone, concentração de substrato, volume do headspace, e concentração dos componentes do meio reacional: NaCl, CaCO3, extrato de levedura e peptona. As variáveis que foram consideradas mais significativas para obtenção de H2 a partir dos resíduos de citros foram adotadas para os ensaios de DCCR (pH, concentração de inóculo alóctone e substrato), onde faixa ótima para estas variáveis por meio de superfície de resposta foi estimada e posteriormente confirmada por meio de um ensaio de validação.

Os ensaios metanogênicos foram realizados após a fermentação dos resíduos sólidos de citros, utilizando como substrato a fração líquida obtida após acidificação, a fim de simular um sistema de duas fases (acidogênica e metanogênica).

Diferentes técnicas de biologia molecular foram empregadas para caracterização microbiana das diferentes etapas da pesquisa. Sequenciamento de Sanger (gene RNAr 16S) foi utilizado para afiliação filogenética da bactéria anaeróbia celulolítica isolada a partir do consórcio autofermentativo dos resíduos de citros, enquanto sequenciamento massivo do gene RNAr 16S (metabarcoding) foi utilizado para caracterização das comunidades

microbianas envolvidas nos ensaios fermentativos contendo resíduo sólido de citros após diferentes pré-tratamentos (in natura moído e após hidrotermólise), bem como para comparação entre a fase acidogênica (Fase I) e fase metanogênica (Fase II) a partir da fração líquida da Fase I. Por fim, utilizou-se a técnica de metagenômica shotgun para avaliar a comunidade microbiana e as vias metabólicas envolvidas no ensaio de validação da condição otimizada, em comparação com o inóculo alóctone utilizado nestas condições (lodo UASB/vinhaça).

A comparação entre os diferentes ensaios foi realizada por meio de dados obtidos pela caracterização do conteúdo de biogás (H2, CH4), compostos orgânicos (AOV, álcoois), carboidratos totais e fenóis. Além disso, realizou-se a quantificação do teor de limoneno na fração líquida dos diferentes ensaios, a partir de metodologia via Cromatografia Líquida Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas (GC-MS), desenvolvida e validada no presente estudo. Encontra-se resumida na Figura 4.1 as diferentes etapas da pesquisa.

microbiana (em roxo).

4.2 SUBSTRATO

4.2.1 Resíduos de citros

Os resíduos de citros in natura, utilizados como substrato para obtenção de inóculo autóctone e para os ensaios de obtenção de biogás, foram produzidos no Laboratório de Processos Biológicos da Universidade de São Paulo, campus São Carlos, espremendo laranjas do tipo pera (Citrus sinensis L. Osbeck, var. Pera-Rio), frescas e maduras, para remoção do suco e das sementes e separando suas cascas e bagaços, a fim de obter um resíduo semelhante ao das plantas industriais.

O armazenamento foi realizado conforme descrito em Calabrò et al. (2016), sendo o resíduo desidratado em estufa de secagem a 50 °C durante 24 h e depois moído em moinho de facas (tipo Wiley TE-650/1) até que partículas ≤1mm fossem obtidas e acondicionadas em frascos plásticos a 4 °C até o momento de sua utilização.

4.2.2 Pré-tratamentos

Os resíduos (cascas e bagaço) foram submetidos aos pré-tratamentos de hidrotermólise e deslignificação alcalina. Após aplicação desses pré-tratamentos, a separação do resíduo foi realizada por filtração em membrana com porosidade de 0,1 mm.

A fração sólida foi lavada com água ultrapura para remoção dos açúcares residuais e utilizada nos ensaios subsequentes.

Ensaios em reatores anaeróbios em batelada foram conduzidos com os resíduos pré-tratados e ensaios controle com resíduos sem pré-tratamento utilizando as mesmas proporções (15 g.L^-1) de resíduo de citros.

4.2.2.1 Hidrotermólise

O pré-tratamento do resíduo (cascas e bagaço) por meio de hidrotermólise foi realizado em reator de bancada, sob pressão de 10 bar a 180 °C por período de 15 minutos e com a massa total de 1,5% de substrato, como descrito em Jacquet et al. (2011) e Soares et al. (2017a). Após a explosão, a fração sólida foi levada para secagem em estufa a 50 °C e a fração líquida foi armazenada em frascos plásticos a -20 °C.

O reator hidrotérmico utilizado (Figura 4.2) foi desenvolvido em parceria entre o Laboratório de Processos Biológicos (LPB) da Escola de Engenharia de São Carlos da Universidade de São Paulo (EESC-USP) e o Departamento de Engenharia Mecânica da mesma escola. Este reator foi confeccionado em aço e é composto pelo reservatório, com capacidade total de 200 mL, no qual ocorre o aquecimento da água e da biomassa na

temperatura programada via painel de controle derivativo integral proporcional (PID); e do ciclone, no qual ocorre a separação da fração sólida e líquida após a abertura da válvula de explosão, sendo o resíduo pré-tratado coletado no funil de captação. A pressão máxima alcançada neste equipamento é de 50 bar.

Figura 4.2. Esquema do reator hidrotérmico.

Fonte: Elaboração própria.

A severidade do tratamento foi calculada de acordo com Jacquet et al. (2011), por meio da Equação 4.1

𝑆𝑒𝑣𝑒𝑟𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 = ∫ 𝑒𝑥𝑝

𝑡 0

[𝑇(𝑡) − 100

14,75 ] 𝑑 × 𝑡 (𝐸𝑞. 4.1) sendo,

t= tempo (min), T= temperatura (°C).

4.2.2.2 Deslignificação alcalina

Os ensaios de deslignificação alcalina foram realizados de acordo com Cabrera et al. (2014). Para tanto, adicionou-se 2,5 g de resíduo a solução de hidróxido de sódio (NaOH) e 1% de peróxido de hidrogênio (H2O2), ajustada para pH 11,5 (± 0,2) com NaOH 5 mol.L^-1 durante 24 h. A proporção de sólido/líquido utilizada foi de 1:20 (peso/volume).

A fração sólida obtida após centrifugação foi utilizada como substrato nos ensaios para obtenção de biogás.

4.3 ENSAIOS CINÉTICOS EM BATELADA