ESTÍMULO PARA LIBERAÇÃO DE NO

Como F0.9 não apresentou toxidade para as células RAW, então elas foram utilizadas como modelo para se verificar a capacidade de F0.9 modular a produção de óxido nítrico. Como visto na figura 16, F0.9 (100 µg/mL) foi capaz de estimular a produção de NO a ponto de fazer com que sua concentração fosse seis vezes maior do que aquela encontrada com o controle (Figura 17). Resultado semelhante foi observado com o controle positivo, o fucoidan (polissacarídeo sulfatado de alga marrom).

Figura 17: Quantidade de NO produzido por células RAW na presença ou ausência de F0.9.

As células foram expostas a diferentes concentrações de F0.9 ou fucoidan (100 µg/mL) por 24 h. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão das médias (n= 3) *** p < 0,001 em relação ao controle.

4.9. ESTÍMULO PARA LIBERAÇÃO DE TNF-α

Também se utilizou as células RAW como modelo para se verificar a capacidade de F0.9 modular a produção de TNF-α.

Assim como o fucoidan, F0.9 foi capaz de estimular a liberação de TNF-α pelas células RAW para o meio extracelular. Este efeito foi dose dependente (Figura 18).

Figura 18: Quantidade de TNF-α liberado para o meio extracelular por células RAW na presença ou ausência de polissacarídeos sulfatados. As células foram expostas a diferentes concentrações de F0.9 ou fucoidan (100 µg/mL) por 24 h. Os resultados estão expressos como média desvio padrão das médias (n= 3). *** p < 0,001 em relação ao controle

5 DISCUSSÃO

Os trabalhos realizados com algas verdes utilizam uma metodologia de obtenção de polissacarídeos que se baseia principalmente na extração destes compostos com água destilada em temperatura ambiente, fria e/ou quente, e no fracionamento com colunas de troca iônica e/ou de gel filtração (MATSUBARA et al., 2001; SIDDHANTA et al., 1999; HAYAKAWA et al., 2000). Entretanto neste estudo utilizou-se uma metodologia simples, desenvolvida pelo grupo em que está inserida esta dissertação, de extração e fracionamento de polissacarídeos sulfatados de algas marinhas (ROCHA et al., 2005) Após o fracionamento com volumes crescentes de acetona verificou-se que o rendimento percentual das frações obtidas, como também, a composição de açúcar em cada fração apresentou-se de forma distinta nas cinco frações ricas em polissacarídeos (F0.3, F0.5, F0.7, F0.9 e F1.2). Frações semelhantes foram obtidas por Farias et al. (2008) e Sabry (2010).

Com C. isthmocladum a quantidade de material obtido se distribuiu de forma mais equivalente, ou seja, quatro das cinco frações obtidas demonstraram um rendimento muito semelhante. A maior quantidade de material foi obtida em frações extraídas com volumes menores de acetona (F0.3, F0.5, F0.7 e F0.9). Outra alga verde que teve seus polissacarídeos obtidos pelo mesma metodologia foi a Caulerpa

cupressoides. Contudo, neste caso os maiores rendimentos foram encontrados com

aquelas frações obtidas com volumes intermediários (F0.5 e F1.0) de acetona (COSTA et al., 2012). Portanto, apesar de não se ter outros exemplos, os dados apontam para o fato de que o rendimento do fracionamento com acetona é inerente de cada espécie de alga verde.

Polissacarídeos obtidos de algas verdes têm mostrado uma baixa contaminação protéica (SIDDHANTA et al., 1999; HAYAKAWA et al., 2000; COSTA

et al., 2012). Resultados semelhantes foram observados para as frações

polissacarídicas obtidas da C. isthmocladum, nas quais se observa valores variando entre 0.5% a 3.2%. Após revisão bibliográfica não se pôde identificar trabalhos que relatassem alto teor de contaminação protéica em polissacarídeos sulfatados de algas verdes, o que indica que as diferentes metodologias utilizadas na extração e fracionamento desses polissacarídeos são eficazes para evitar que as frações obtidas dessas algas estejam altamente contaminadas com proteínas.

As frações cetônicas F0.5, F0.7 e F0.9 da alga C. isthmocladum apresentaram maior quantidade de polissacarídeos totais. Em estudos realizados pelo grupo de pesquisa em que se insere este trabalho, utilizando a mesma metodologia, foi possível verificar a mesma distribuição de açúcares nas frações obtidas (ROCHA et al., 2005; COSTA et al., 2011). Esses resultados demonstraram que as primeiras frações são as possuidoras de maior quantidade de polissacarídeos, com exceção da primeira fração (F0.3). Fato explicado devido a utilização da acetona para promover o fracionamento, este solvente também promove a precipitação de várias outras substâncias que fez com que F0.3 tenha um alto teor de contaminantes e consequentemente baixa quantidade de açúcar.

Segundo Hayakawa et al. (2000), quatro espécies do gênero Codium e duas espécies do gênero Caulerpa apresentaram polissacarídeos pouco sulfatados (no máximo 0.7% de sulfato). Em contrapartida, frações de polissacarídeos altamente sulfatados foram obtidas da Codium dwarkense (no mínimo 26,04% de sulfato), segundo Siddhanta et al. (1999). Os dados acima descritos mostram que na

literatura, é possível encontrar em algas verdes polissacarídeos com graus diferentes de sulfatação. Na alga utilizada nesse trabalho pode-se observar a presença de sulfato em todas as frações, variando entre 2.9 e 12.3% (Tabela 03). Os resultados obtidos nesse trabalho se localizam em uma faixa intermediária de sulfatação se comparado com os outros trabalhos citados, o que indica que o grau de sulfatação pode variar devido a diversos fatores como: metodologia de extração e fracionamento, quantidade de frações obtidas, espécie estudada, etc.

A comprovação da presença de polissacarídeos foi realizada através da utilização da técnica de eletroforese em gel de agarose. Foi possível observar, em nossos resultados, a existência de diferentes bandas eletroforéticas, o que indica a presença de várias populações de polissacarídeos decorrentes do fracionamento com volumes crescentes com acetona. A F0.5 apresentou em sua composição diferentes populações (bandas) de polissacarídeos sulfatados, o que pôde ser confirmado pelo seu perfil eletroforético. Com relação a F0.9 se observa apenas uma banda eletroforética, o que indica a presença de uma população mais homogênea.

A composição monossacarídica das frações ricas em polissacarídeos leva a observação de que todas as frações são constituídas de galactose, manose, arabinose e traços de xilose. Cada fração possui um ou dois monossacarídeos como principais constituintes, por exemplo, F0.7 e F0.9 são constituídas principalmente por galactose e manose, o que evidencia que diferentes polissacarídeos são encontrados nas frações. Essa heterogeneidade de monossacarídeos também é observada para polissacarídeos sulfatados de outras espécies de Clorophyta como a

Ulva conglobata (MAO et al., 2006); e para espécies de Caulerpa como a C.

entanto, homopolímeros já foram obtidos, como arabinanas e galactanas, de espécies Codium (FARIAS et al., 2008; SABRY, 2010; FERNANDEZ et al., 2013). Há uma predominância de um monossacarídeo em detrimento de outros monossacarídeos em certas famílias de algas. Por exemplo, os polissacarídeos de algas de Codiaceae, como C. isthmocladum, são compostos, principalmente, de arabinose e galactose, os da Caulerpaceae, são compostos, principalmente, de galactose, já os de Ulvaceae, apresentam a ramnose como principal monossacarídeo (HAYAKAWA et al, 2000; MAO et al, 2006). No entanto, as evidências existentes são insuficientes para estabelecer uma relação sistemática entre a estrutura, incluindo a composição monossacarídica, e a filogenia das algas.

Há várias atividades atribuídas a polissacarídeos sulfatados de algas verdes descritas na literatura como, anticoagulante (CIANCIA et al., 2007; Sabry, 2010), antiviral (GHOSH et al., 2004; LEE et al., 2004) e anti-hepatotóxica (RAO et al., 2004) entretanto há apenas um trabalho que avaliou atividade antinociceptiva de polissacarídeos obtidos de algas verdes que foi realizado por Rodrigues et al. (2012). Portanto, ainda há muito a ser estudado sobre o tema nocicepção e polissacarídeos sulfatados de algas verdes. Assim, neste estudo avaliou-se o efeito de polissacarídeos sulfatados da alga C.isthmocladum em vários modelos in vivo de nocicepção.

A administração intraperitoneal de agentes irritantes provoca um comportamento estereotipado nos camundongos, que é caracterizado por contrações abdominais. A administração de ácido acético no peritônio desses animais é um modelo clássico de avaliação de atividade antinociceptiva de compostos (BARS et al., 2001). Assim, este teste foi utilizado para se fazer uma varredura da atividade antinociceptiva das frações ricas em polissacarídeos obtidas

da alga C. isthmocladum. De todas as frações analisadas a fração F0.9 teve maior efeito antinociceptivo. Outro fato interessante com relação a heterogalactana F0.9 (20 mg/Kg) é que ela apresentou potencia semelhante a dipirona (20 mg/Kg).

Os dados obtidos posteriormente, mostraram que a heterogalactana F0.9 já apresenta atividade antinociceptiva máxima com 90 minutos numa dose de 10 mg/Kg. Por outro lado a heterogalactana F0.9 não foi capaz de inibir a sensação dolorosa no teste da placa quente. Este teste avalia se um composto possui um mecanismo antinociceptivo via sistema nervoso central. Os dados evidenciaram que a galactana F0.9 possui um mecanismo antinociceptivo periférico, não afetando o sistema nervoso central. O que faz da galactana F0.9 um potencial analgésico específico, que não afeta o sistema nervoso central, diferente de outras galactanas sulfatadas, como a galactana de Bryothamnion seaforthii que, por agir no sistema nervos central, aumentou o tempo de sono dos animais tratados (VIEIRA et al., 2004).

Há poucos trabalhos que avaliaram a atividade antinociceptiva de polissacarídeos sulfatados, com exceção do trabalho de Farias et al. (2011), todos os outros utilizaram o método de contração induzida por ácido acético. A galactana sulfatada da alga vermelha Bryothamnion seaforthii foi menos potente que a galactana F0.9, inibindo o número de contrações em apenas 74% (VIEIRA et al., 2004), assim como as galactanas sulfatada das algas vermelhas Bryothamnion

triquetrum (82% de inibição) (VIANA et al., 2002), Champia feldmannii (~ 60%)

(ASSREUY et al., 2008), Gracilaria cornea (65 %) (COURA et al., 2012) e Solieria

filiformis (70 %) (ARAÚJO et al.,2011). A única alga verde que teve seu

polissacarídeo avaliado como antinociceptivo foi a Caulerpa cupressoides, a galactana sulfatada obtida desta alga inibiu em cerca de 90% o número de

contrações dos camundongos (RODRIGUES et al., 2012). Estes dados mostram que a galactana F0.9 é o mais potente antinociceptivo purificado de alga já descrito.

A irritação local induzida pelo ácido acético induz a liberação de vários mediadores endógenos, inclusive TNF-α e interleucinas que estimulam os neurônios nociceptivos (IKEDA et al., 2001). Além de ser influenciada por mediadores inflamatórios a nocicepção induzida pelo ácido acético também pode ser estimulada pela liberação de prótons H+ _{para o meio e ativarem receptores TRPV1 e TRPA1} localizados nos neurônios aferentes primários (COUTAX et al., 2005). Os dados com as células RAW mostraram que a galactana F0.9 estimula a liberação de NO e TNF- α. Por outro lado, os dados com animais mostraram que F0.9 diminui a nocicepção induzida pelos ativadores de TRPV1 (capsiacina) e TRPA1(cinamaldeído), bem como alodínia provocada pelo processo inflamatório causado por capsiacina e cinamaldeído. O que leva a proposição de que o mecanismo de ação da galactana F0.9 como agente antinociceptivo está relacionado com sua capacidade de inibir estes canais. Não há descrição do mecanismo de ação antinociceptivo de outros polissacarídeos sulfatados. Porém, espera-se que com os avanços dos estudos realizados pelos pesquisadores da área, surjam novos dados e com eles propostas de mecanismos de ação que sejam comparados com o sugerido neste trabalho.

A galactana F0.9 foi capaz de inibir a migração de leucócitos para a cavidade peritoneal após estimulo químico. Este é um dos principais teste utilizados para indicar se um composto possui potencial anti-inflamatório. Esta atividade também já foi observada com outros polissacarídeos sulfatados de algas, inclusive de algas marrons. Os dois principais mecanismos propostos para esta ação são; 1) o polissacarídeo diminui a quantidade de moléculas quimioatraentes, como NO, TNF-α e interleucinas. Os dados com macrófagos em cultura mostram que a galactana F0.9

estimula a liberação de NO e TNF-α, o que deveria induzir a migração de leucócitos para a cavidade peritoneal. Portanto, este não deve ser o mecanismo de ação de F0.9. Uma hipótese aqui proposta é que a galactana esteja se associando ao TNF-α e impedindo sua ação. 2) Outra hipótese, viria do fato de polissacarídeos sulfatados se associarem a receptores superfície de leucócitos e impedirem a sua rolagem nos vasos sanguíneos, o que parece ser o mecanismo de ação da galactana F0.9. Corrobora com esta proposta os dados obtidos com o fucoidan da alga Fucus

vesiculosos, este composto é um polissacarídeo sulfatado amplamente conhecido

como inibidor de rolagem de leucócitos (PREOBRAZHENSKAYA et al., 1997), mas que também estimula a síntese e liberação de NO, TNF-α e interleucinas (DO et al., 2010). Contudo, estas duas hipóteses precisam ser confirmadas ou descartadas em estudos futuros.

Os dados mostraram que F0.9 possui atividade antinociceptiva e anti- inflamatória e que o principal responsável por ela são heterogalactanas sulfatadas encontradas em sua composição. Espera-se no futuro purificar estas galactanas e avaliá-las como agentes antinociceptivos e anti-inflamatórios.

6 CONCLUSÕES

 Todas as frações cetônicas obtidas são constituídas por polissacarídeos sulfatados;

 As frações cetônicas apresentaram baixa contaminação protéica e são compostas por, basicamente, galactose, arabinose, manose e traços de xilose;  A F0.9 é constituída por heterogalactana sulfatada.

 A F0.9 apresentou excelente efeito antinociceptivo no teste indução de contrações abdominais por ácido acético, indicando que estes polissacarídeos agem sobre o sistema nervoso periférico.

 A F0.9 não teve efeito antinociceptivo no teste de placa quente, o que indica que estes polissacarídeos não agem via sistema nervoso central;

 A antinocicepção causada pela F0.9 depende parcialmente da inibição dos receptores TRPV1 e TRPA1.

 A F0.9 foi capaz de inibir a migração de leucócitos ao peritoneum. Como também, estimulou a liberação de NO e TNF-α.

REFERÊNCIAS

Albuquerque, I. R. L. Purificação e Caracterização parcial de uma fucana C de

Dictyota menstrualis e estudo de efeito antiinflamatorio e antonoceptivo. 2005.

82f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica). Programa de Pós-graduação em Bioquímica. Departamento de Bioquímica. Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN, Natal, 2005.

ALVES, L. G. Polissacarídeos ácidos presentes no folíolo, talo e flutuador da alga marinha Sargassum vulgare. 2000. 86f. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-graduação em Bioquímica. Departamento de Bioquímica. Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN, Natal, 2000.

ARAUJO, I. W. F., et. al. Effects of a sulfated polysaccharide isolated from the red seaweed Solieria filiformis on models of nociception and inflammation. Carbohydr Polym, v. 86, n. 3, p. 1207-1215, 30 / Aug. / 2011.

ASSREUY, A. M., et. al. Biological Effects of a Sulfated-Polysaccharide Isolated from the Marine Red Algae Champia feldmannii. Biol Pharm Bull, Japan, v. 31, n. 4, p. 691-695, Apr. / 2008.

ATHUKORALA, Y.; LEE, K. W.; KIM, S. K.; JEON, Y. J. Anticoagulant activity of marine green and brown algae collected from Jeju Island in Korea. Bioresour Technol, England, v. 98, n. 9, p. 1711-1716, July / 2007.

BILAN, M. I.; VINOGRADOVA, E. V.; SHASHKOV, A. S. USOV, A. I. Structure of a highly pyruvylated galactan sulfate from the Pacific green alga Codium yezoense (Bryopsidales, Chlorophyta). Carbohydr Res, Netherlands, n. 342, n. 3-4, p. 586- 596 26 / Feb. / 2007.

BILAN, M.I. AND A.I. USOV, Structural Analysis of Fucoidans. Natural Product Communications, 3(10): p. 1639-1648, 2008.

BOVIM G, SCHRADER H, SAND T. Neck pain in the general population.. Spine, 19:1307-1309, 1994.

CARDOZO, F. T, et. al.. Antiherpetic activity of a sulfated polysaccharide from Agaricus brasiliensis mycelia. Antiviral Res, Netherlands, v. 92, n.1, p. 108-14, Oct./ 2011.

CIANCIA, M.; QUINTANA, I. CEREZO, A. S. Overview of anticoagulant activity of sulfated polysaccharides from seaweeds in relation to their structures, focusing on those of green seaweeds. Curr Med Chem, Netherlands, v. 17, n. 23, p. 2503-2529, 2010.

CIANCIA, M., et. al.. Polysaccharides from the green seaweeds Codium fragile and

C. vermilara with controversial effects on hemostasis. Int J Biol Macromol,

Netherlands, v. 41, n. 5, p. 641-649, 1 / Dec. / 2007.

COSTA, L. S. , et. al. Biological activities of sulfated polysaccharides from tropical seaweeds. Biomed Pharmacother, France, v. 64, n. 1, p. 21-28, Jan. / 2010.

COSTA, L. S. , et. al. Antioxidant and antiproliferative activities of heterofucans from the seaweed Sargassum filipendula. Mar Drugs, Switzerland, v. 9, n. 6, p. 952-966, 2011.

COSTA, M. S. S. P. , et. al. O. Evaluating the possible anticoagulant and antioxidant effects of sulfated polysaccharides from the tropical green alga Caulerpa

cupressoides var. flabellata. J Appl Phycol, Netherlands, v. 24, n. 5, p. 1159-1167,

Oct. / 2012.

COURA, C. O., et. al.. Antinociceptive and anti-inflammatory activities of sulphated polysaccharides from the red seaweed Gracilaria córnea. Basic Clin Pharmacol Toxicol, England, v. 110, n. 4, p. 335-341, Apr. / 2012.

DANTAS-SANTOS, N., et. al. Freshwater Plants Synthesize Sulfated Polysaccharides: Heterogalactans from Water Hyacinth (Eicchorniacrassipes). Int J Mol Sci., Switzerland, v. 13, n. 1, p. 961-976, 2012.

DEACON-SMITH, R. A.; LEE-POTTER, J. P.; ROGERS, D. J. Anticoagulant activity in extracts of British marine algae. Bot mar, Berlin, v. 28, n. 8, p. 333-338,1985. DIETRICH, C. P. , et. al. A new aproach for characterization of polysaccharides from algae: presence of four main acidic pollysaccharides in three specie of the class Phaeophycea. Plant Sci, Ireland, v. 108, n. 2, p. 143-153, 30 / June / 1995.

DIETRICH CP, DIETRICH SMC. Electrophoretic behavior of acidic mucopolysaccharides by agarose gel electrophoresis. J Chromatogr., 130: 299-304, 1976.

DIETRICH CP, et. al. A new aproach for characterization of polysaccharides from algae: presence of four main acidic pollysaccharides in three specie of the class Phaeophycea. Plant Sci., 108: 143-53, 1995.

DO, H., et. al. Differential Regulation by Fucoidan of IFN-g-Induced NO Production in Glial cells and Macrophages. J Cell Biochem. v. 111, n. 5, p. 1337-1345, 1 / Dec. / 2010.

DODGSON KS, PRICE RG. A note on the determination of the ester sulphate content of sulphated polysaccharides.Biochem. J., 84: 106-10, 1962.

ERMAKOVA, S., et. al. Fucoidans from brown seaweeds Sargassum hornery, Eclonia cava, Costaria costata: structural characteristics and anticancer activity. Appl Biochem Biotechnol, United States, v. 164, n. 6, p. 841-850, July / 2011.

ESTEVEZ, J. M., et. al.. Chemical and in situ characterization of macromolecular

components of the cell walls from the green seaweed Codium fragile. Glycobiology, England, v. 19, n. 3, p. 212-28, Mar. / 2009.

FARIAS, E. H. C. Homogalactanas sulfatadas da alga Codium isthmocladum com atividade anticoagulante. 2006. 74f. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-graduação em bioquímica. Departamento de Bioquímica. Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN, Natal, 2006.

FARIAS, E. H., et. al. A preponderantly 4-sulfated, 3-linked galactan from the green alga Codium isthmocladum. Glycobiology, Engalnd, v. 18, n. 3, p. 250-259, 2008. FARIAS, W. R., et. al. A novel antinociceptive sulphated polysaccharide of the brown marine alga Spatoglossum schroederi. Nat Prod Commun. ;6(6):863-6. 2011.

FERNÁNDEZ, P. V., et. al.. Anticoagulant activity of a unique sulfated pyranosic (1- 3)-β-l-arabinan through direct interaction with thrombin. J Biol Chem, United States, v. 288, n. 1, p. 223-233, 4 / Jan. / 2013.

GHOSH, P., et. al. In vitro anti-herpetic activity of sulfated polysaccharide fractions from Caulerpa racemosa. Phytochemistry, England, v. 65, n. 23, p. 3151-3157, Dec. / 2004.

HAROUN-BOUHEDJA, F., et. al.. Relationship between sulfate groups and biological activities of fucans. Thromb Res, United States, v. 100, n. 5, p. 453-459, Dec. / 2000.

HAYAKAWA, Y., , et. al. Inhibition of thrombin by sulfated polysaccharides isolated from green algae. Biochim Biophys Acta, Netherlands, v. 1543, n. 1, p. 86-94, 30 / Nov. / 2000.

HEIDARI MR, AZADA EM, MEHRABANI M. Evaluation of the analgesic effect of Echium amoenum Fisch & C.A. Mey. extract in mice: Possible mechanism involved. Journal of Ethnopharmacology, 103(3): 345-349, 2006..

IKEDA, Y.; UENO, A.; NARABA, H.; OH-ISHI, S. Invovement of vanilloid receptor VR1 and prostanoids in the acid-induced whithing responses of mice. Life Sci, Netherlands, v. 69, n. 24, p. 2911-2919, Nov. / 2001.

JIAO, G.; YU, G.; ZHANG, J.; EWART, H. S. Chemical structures and bioactivities of sulfated polysaccharides from marine algae. Mar Drugs, Switzerland, v. 9, n. 2, p. 196-223, 8 / Feb. / 2011.

JURD, K. M., et. al. Anticoagulant properties of sulfated polysaccharides and a proteoglycan from Codium fragile ssp. J. appl. Phycol. 1995.

KAEFFER, B. , et. al. Biological properties of ulvan, a new source of green seaweed sulfated polysaccharides, on cultured normal and cancerous colonic epithelial cells. Planta Med, Germany, v. 65, n. 6, p. 527-531, Aug. / 1999.

KOBAYASHI, Y. Papers from seaweeds--manufacture and applications of alginate fiber papers. Tanpakushitsu Kakusan Koso, Japan, v. 31, n.11, p. 1066-1077, Sep./1986.

KOSTER R, ANDERSON M & DE BEER EJ. Acetic acid for analgesic screening. Federation Proceedings, 18: 412-417, 1959.

KUMMER CL, COELHO TCRB. Cycloxygenase-2 Inhibitors Nonsteroid Anti- Inflammatory Drugs:Current Issues. Rev Bras Anestesiol, 52: 4: 498 – 512, 2002. LAHAYE, M. ROBIC, A. Structure and functional properties of ulvan, a polysaccharide from green seaweeds. Biomacromolecules, United States, v. 8, n. 6, p. 1765-1774, June / 2007.

LEE, J. B.; HAYASHI, K.; MAEDA, M.; HAYASHI, T. Antiherpetic activities of sulfated polysaccharides from green algae. Planta Med, Germany, v. 70, n. 9, p. 813-817, Sep. / 2004.

LEE, J. B., et. al. Immunostimulating effects of a sulfated galactan from Codium fragile. Carbohydr Res, Netherlands, v. 345, n. 10, p. 1452-1454, 2 / July / 2010. LEITE EL,, et. al. Structure of a new fucan from the algae Spatoglossum Schröederi. Plant Science, 132: 215-228, 1998.

MAO, W.; ZHANG, X.; LI, Y.; ZHANG, H.Sulfated polysaccharides from marine green algae Ulva conglobata and their anticoagulant activity. J Appl Phycol, Netherlands, v. 18, n. 1, p. 9-14, Feb. / 2006.

MAO, W., et. al.. Chemical characteristic and anticoagulant activity of the sulfated

polysaccharide isolated from Monostroma latissimum (Chlorophyta). Int J Biol Macromol, Netherlands, v. 44, n. 1, p. 70-74, 1 / Jan. / 2009.

MATSUBARA, K., et. al. Antiangiogenic properties of a sulfated galactan isolated from a marine green alga, Codium cylindricum. J Appl Phycol, Netherlands, v. 15, n. 1, p. 87-90, Jan. / 2003.

MATSUBARA, K. , et. al.. Anticoagulant properties of a sulfated galactan preparation from a marine green alga, Codium cylindricum. Int J Biol Macromol, Netherlands, v. 28, n. 5, p. 395-399, 12 / June / 2001.

MATSUBARA K, et. al. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme and identification of fibrinogen clotting enzyme in a marine green alga, Codium divaricatum. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 125(1):137-43, 2000. MCHUGH, D. J. A guide to the seaweed industry.A guide to the seaweed industry. In: PAPERS, F. F. T. (ed.). Rome: FAO. 2003.

MEDEIROS, G. F. , et. al. Distribution of sulfated glycosaminoglycans in the animal kingdom: widespread occurrence of heparin-like compounds in invertebrates. Biochim Biophys Acta, Netherlands, v. 1475, n. 3, 287-294, 26 / Jul / 2000.

MICHEL, G., et. al. The cell wall polysaccharide metabolism of the brown alga Ectocarpus siliculosus. Insights into the evolution of extracellular matrix polysaccharides in Eukaryotes. New Phytol, England, v. 188, n. 1, p. 82-97, Oct. / 2010.

MINHAS, K. S., et. al. Flow behavior characteristics of ice cream mix made with buffalo milk and various stabilizers. Plant Foods Hum Nutr, Netherlands, v. 57, n. 1, p. 25-40, winter/ 2002.

MOSMANN T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. v. 65, n (1-2), p. 55-63, 1983

OHTA Y, LEE J, HAYASHI K HAYASHI T. Isolation of Sulfated Galactan from

Codium fragile and Its Antiviral Effect. Biol. Pharm. Bull. 32(5) 892—898, 2009.

PENGZHAN, Y., et. al. Antihyperlipidemic effects of different molecular weight sulfated polysaccharides from Ulva pertusa (Chlorophyta). Pharmacol Res, England, v. 48, n. 6, p. 543-549, Dec. / 2003.

POMIN, V. H.; MOURÃO, P. A. Structure, biology, evolution, and medical importance of sulfated fucans and galactans. Glycobiology, England, v. 18, n. 12, p. 1016-1027, Dec. / 2008.

PREOBRAZHENSKAYA, M. E., et. al. Fucoidan inhibits leukocyte recruitment in a model peritoneal inflammation in rat and blocks interaction of P-selectin with its