Estabelecimento in vitro de plantas axênicas e de

4.2.2.1 Passiflora setacea

4.2.2.1.1 Cultura de calos a partir de diferentes tipos de explantes de plântulas axênicas

Para o estabelecimento in vitro de plântulas de P. setacea, as sementes foram lavadas com água de torneira e detergente neutro, enxaguadas quatro vezes e, em fluxo laminar, foram imersas por 10 minutos em solução comercial de hipoclorito de sódio (Q-Boa) com 2,5% (v/v) de cloro ativo, acrescida de algumas gotas de detergente. Em seguida, foram enxaguadas por quatro vezes com água destilada esterilizada para a remoção de resíduos de hipoclorito e detergente e inoculadas em meio de cultura MS suplementado com 59 mM de sacarose e 0,2% (m/V) de Phytagel, conforme descrito anteriormente. Após a inoculação das sementes, os tubos foram cobertos e vedados com filme de polipropileno (76 mm x 76 mm). As culturas foram mantidas em sala de crescimento com temperatura controlada de 25 ± 2ºC, sob fotoperíodo de 16 horas, provido por lâmpadas fluorescentes Philips TDL (22,3 µmol.m-².s-¹) e umidade relativa de 70%. Estas condições foram utilizadas em todos os experimentos, exceto quando especificado.

Após 8 semanas, as plântulas axênicas produzidas a partir da germinação in vitro das sementes foram removidas dos tubos de ensaio e segmentos (1 cm de comprimento) de raiz, hipocótilo, cotilédone, nó cotiledonar e nó foliar foram removidos e inoculados em meio de cultura MS semi-sólido, suplementado com 88,5 mM de sacarose, 0,2% (m/V) de Phytagel e 2,5 µM de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). Os calos obtidos foram multiplicados em ciclos de 30 dias, transferindo- se segmentos de 80 mg de massa fresca para o mesmo meio de cultura citado acima, para prover a biomassa necessária para as análises fitoquímicas e de atividade biológica. Após 30, 45 e 60 dias, as culturas foram avaliadas quanto às massas fresca e seca dos calos, que foram coletados para as análises.

As plantas de P. setacea, utilizadas como fontes de explantes de caules, foram obtidas através da cultura de segmentos apicais de ramos (3-4 cm de comprimento), contendo a gema apical e duas gemas axilares removidos de plantas axênicas de 12 semanas de idade, produzidas a partir da germinação de sementes in vitro. Os segmentos apicais foram transferidos para o meio de cultura MS semi-sólido suplementado com 59 mM de sacarose e 0,2% (m/V) de Phytagel.

Após 8 semanas, as plantas produzidas in vitro foram removidas dos tubos de ensaio e segmentos de caules (5 mm de comprimento) foram removidos e inoculados, na posição horizontal, em meio de cultura MS suplementado com 88,5 mM de sacarose, 0,2% de Phytagel e 2,5 µM de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). Os calos obtidos foram multiplicados em ciclos de 30 dias, transferindo-se segmentos de 80 mg de massa fresca para o mesmo meio de cultura citado acima, para prover a biomassa necessária para as análises fitoquímicas e de atividade biológica. Após 30, 45 e 60 dias, as culturas foram avaliadas quanto às massas fresca e seca dos calos, que foram coletados para as análises.

4.2.2.2 Passiflora tenuifila

4.2.2.2.1 Cultura de calos a partir de sementes imaturas

Os calos de sementes imaturas de P. tenuifila foram obtidos a partir dos seguintes procedimentos: frutos verdes, em desenvolvimento, de P. tenuifila foram coletados, lavados com água corrente e detergente comercial e imersos em álcool comercial por 5 min. Em seguida, foram dissecados e as sementes removidas e inoculadas em meio de cultura MS semi-sólido, suplementado com 88,5 mM de sacarose, 0,2% (m/V) de Phytagel e 2,5 µM de ácido 2-4-diclorofenóxiacético (2,4-D). Após a inoculação, os tubos foram cobertos e vedados com filme de polipropileno (76 mm x 76 mm). As culturas foram mantidas em sala de crescimento com temperatura controlada de 25 ± 2ºC, sob fotoperíodo de 16 horas, provido por lâmpadas fluorescentes Philips TDL (22,3 µmol.m-².s-¹) e umidade relativa de 70%. Estas condições foram utilizadas em todos os experimentos, exceto quando especificado.

Os calos obtidos foram multiplicados em ciclos de 30 dias, transferindo-se segmentos de 80 mg de massa fresca para o mesmo meio de cultura citado acima, para prover a biomassa necessária para as análises fitoquímicas e de atividade biológica. Após 45, 60 e 75 dias, as culturas foram avaliadas quanto às massas fresca e seca dos calos, que foram coletados para as análises.

4.2.2.2.2 Cultura de calos a partir de segmentos de caules

As plantas de P. tenuifila foram estabelecidas in vitro através da cultura de segmentos apicais de ramos (3-4 cm de comprimento), contendo a gema apical e duas gemas axilares, que foram removidos de plantas de 12 semanas de idade, crescidas em casa de vegetação, a partir da germinação de sementes em solo. Os segmentos apicais foram lavados com 100 ml de água de torneira e 1 ml de detergente neutro e enxaguados cinco vezes, também com água de torneira. No fluxo laminar, foram imersos em solução de álcool 70%, por 1 minuto e 30 segundos, lavados com água destilada esterilizada, imersos em solução de hipoclorito comercial, contendo 2,5% de cloro ativo, por 2 minutos e 30 segundos e lavados cinco vezes em água destilada esterilizada. Em seguida, os segmentos apicais tiveram 5 mm da região basal do caule removida e foram inoculados em meio de cultura MSsemi-sólido suplementado com 88,5 mM de glucose, 1,25 µM de ácido indolbutírico (AIB) e 0,2% (m/V) de Phytagel.

Após 8 semanas, as plantas produzidas in vitro foram removidas dos tubos de ensaio e segmentos de caules (5 mm de comprimento) foram removidos e inoculados, na posição horizontal, em meio de cultura MS semi-sólido, suplementado com 88,5 mM de sacarose ou frutose, 0,2% de Phytagel e 2,5 µM de ácido α- naftalenoacético (ANA). Após 45, 60 e 75 dias, as culturas foram avaliadas quanto às massas fresca e seca dos calos, que foram coletados para as análises fitoquímicas.