Estabelecimentos de diretrizes de âmbito amostral

A definição de diretrizes importantes com relação às amostras utilizadas . Entre essas, estão o estabelecimento de arâmetros acerca da montagem de amostras, idade pós-natal a ser trabalhada

(levan ai do primeiro dia

e vida (P1) até o vigésimo primeiro dia de vida (P21), quando o mesmo desmama) e o estab

ca medular

tornar viável técnica da eletroforese bi-dimensional. Ao

.

estabe empre de rato

pistilo pão de extração como descrito

configurou a primeira etapa do estudo p

do-se em contra que o período pós-natal de um rato Wistar v d

elecimento do protocolo para a extração das proteínas medulares.

Levando-se em consideração trabalhos da literatura (Kunz et. al, 2005) e experiência adquirida anteriormente pela associação do próprio laboratório de proteômica da Unicamp com o Laboratório de Neurobiologia do departamento de Fisiologia Animal da Unicamp liderado então pelo Prof. Francesco Langone (Shiniti, 2008), foi planejado realizar todos os experimentos de análise proteômi

utilizando a montagem de um pool de amostras formado por três indivíduos (n=3). A escolha dessa abordagem em detrimento da análise de indivíduos singulares foi baseada por dois motivos:

a) O primeiro foi minimizar a variância dentro da classe, e evidenciar as diferenças entre as classes estudadas, ressaltando assim, as proteínas que são diferencialmente expressas nas classes.

b) O segundo motivo foi a necessidade da obtenção de uma quantidade mínima de proteínas para se

reunir três medulas para formar uma classe, consequentemente, triplica-se a quantidade de proteínas na classe, permitindo assim um maior aproveitamento para a experimentação e obtenção dos dados

Definido como seriam formadas as diferentes classes, houve a necessidade de lecer o protocolo de extração das amostras. O método utilizado foi o mesmo já gado anteriormente por Shiniti (2008), que, para extrair as proteínas medulares s neonatos utilizou o protocolo de associação de lise mecânica, através de para eppendorf e lise química, usando um tam

no ítem

m estudadas as medulas de ratos com quatro dias de vida, s

a as diferenças interclasses (Figura 6).

4.4 em Materiais e Métodos. Dessa forma, as amostras eram imersas em um tampão cujo conteúdo envolvia proteases, agentes caotrópicos, detergentes e agentes redutores de ponte dissulfeto, sendo em seguida maceradas mecanicamente com o pistilo, até todo o tecido ser homogeneizado.

Feito isso, essa mistura foi submetida a 15 minutos de centrifugação a 14000 rpm, coletando o sobrenadante e desprezando o pellet, seguido de uma quantificação pelo método Bradford (Bradford, 1970) e normalização por SDS-PAGE. As amostras foram extraídas individualmente e a formação do pool ocorreu somente posteriormente a esta etapa.

Sabendo que o período pós-natal é de grande importância para a maturação do sistema nervoso, foram levantadas hipóteses para a determinação de qual idade seria estudada. Determinou-se seccionar o nervo ciático dos indivíduos da classe “lesado” com dois dias de vida (P2), no início do período pós-natal. Com isso, estabeleceu-se um ensaio piloto no qual seria

ete dias de vida e vinte e um dias de vida (P4, P7 e P21, respectivamente) a fim de precisar qual a idade em que a medula espinhal apresenta maior diferença de expressão proteica em relação ao controle devido a este estímulo externo (lesão periférica).

O piloto consistia em extrair as proteínas medulares de ratos das duas classes (lesado e controle) nas diferentes idades propostas, formar o pool (n=3) para cada idade e compará-las utilizando um SDS-PAGE padrão, porém com dimensões maiores (180mm x 160mm x 1mm) com intuito de separar as bandas e evidenciar com maior clarez

Figura 6: Perfil eletroforético linear das proteínas medulares em diferentes idades de ratos Wistar neonatos. HMW é o marcador de alto peso molecular e as letras C e L designam as classes Controle e Lesado. As regiões destacadas são as que apresentaram maiores diferenças de expressão entre os grupos comparados.

O resultado obtido é mostrado na figura 6, onde as áreas destacadas mostram as maiores diferenças do perfil eletroforético constatadas ao se comparar as duas classes do estudo. Observa-se uma diferença no padrão de bandas ao comparar as classes controle e lesado na idade P7. Nas outras duas idades, P4 e P21, não foram observadas tais diferenças.

Levantou-se uma hipótese para justificar esse dado, pois se sabe que a medula espinal nas três primeiras semanas de vida do roedor é extremamente sensível a sinais do meio interno, e neste caso, com dois dias de vida houve um sinal bastante marcante (secção de um nervo periférico), fato que com certeza implica na

modificação da expressão de algumas proteínas medulares (Campbell, 2008), porém pode ser que algumas alterações retardem mais a acontecer e posteriormente a expressão de algumas proteínas estabilizam-se. Um exemplo disto são as proteínas ligadas a apoptose e a macrófagos, que são muito evidentes nos momentos seguintes a lesão e com o passar dos dias estabilizam-se, não sendo tão evidenciadas (Richardson e Lu, 1994; Campbell, 2008). Além disso, os receptores NGF apresentam-se com sua densidade aumentada nas células de Schwann por sete dias após a secção no nervo ciático (Taniuchi, et al., 1986) Fatos como estes podem explicar o porquê da comparação das duas classes na idade P21 não ter resultado em tantas diferenças como na idade P7.

Dessa forma, foi estabelecido pelo ensaio piloto que a idade adotada para o decorrer dos experimentos seria a P7, consequentemente foram extraídas as proteínas das medulas dos ratos com sete dias de vida pelo protocolo já descrito (Figura 7).

Figura 7: Gel de poliacrilamida linear contendo as extrações das proteínas medulares dos três indivíduos que formam o pool das classes C (controle) e L (Lesado). As extrações são feitas individualmente, não há formação de pool nesta etapa.

5.2 Padronização da Eletroforese de duas dimensões e da detecção