Estabilidade dos carotenóides no processamento e estocagem de

Devido à presença de muitas duplas ligações na sua estrutura, os carotenóides são susceptíveis a várias reações de degradação durante o processamento e estocagem do alimento. A ocorrência destas reações depende diretamente da concentração de oxigênio, metais, enzimas, lipídeos insaturados, pró-oxidantes ou antioxidantes, exposição à luz, tipo e estado físico do carotenóide presente no alimento, severidade do tratamento térmico, material de embalagem e condições de estocagem. Acredita-se que essa degradação possa levar a perda de cor do alimento, além da redução da atividade biológica dos carotenóides presentes (RODRIGUEZ-AMAYA, 1999; VASQUEZ-CAICEDO et al., 2007a; ZEPKA; MERCADANTE, 2009). Também pode haver formação de compostos do aroma, que podem ser desejáveis ou não no produto (LEWINSOHN et al., 2005; MENDES-PINTO, 2009).

A oxidação pode ocorrer por auto-oxidação, via radicais livres, ou por foto-oxidação, envolvendo o oxigênio singlete (ODRIOZOLA- SERRANO et al., 2009). A presença de calor, luz e oxigênio também pode levar a isomerização das moléculas. No caso do β-caroteno, por exemplo, podem ser encontradas em alimentos as formas 9-cis e 13-cis,

e com menos frequência 15-cis e 13,15-di-cis. A formação de isômeros cis do β-caroteno pode levar a uma diminuição da atividade de vitamina A e decréscimo na intensidade da cor (CHENG; HUANG, 1998; QIU; CHEN; LI, 2009). Porém, em algumas condições, também é possível a isomerização da forma cis para a forma trans, conforme observado por Qiu, Chen e Li (2009).

Em decorrência da instabilidade, na maioria das vezes, o processamento do alimento causa um percentual de degradação dos carotenóides. Dependendo da severidade do tratamento térmico utilizado podem ser induzidas isomerização, degradação oxidativa, entre outras reações (GAMA; SYLOS, 2007).

Pinheiro Sant’ana et al. (1998) estudaram o comportamento de carotenóides, especialmente α- e β-caroteno, em cenouras preparadas por diferentes métodos em um restaurante. O cozimento em água, por 21 minutos, sem aumento da pressão, apresentou os melhores resultados em relação à retenção dos carotenóides quando comparado com outros tratamentos que utilizam temperaturas maiores. Além disso, o cozimento em água também apresentou maior retenção de carotenóides que amostras de cenouras cruas raladas que foram expostas a luz e oxigênio por 3 horas. O estudo realizado por Qiu, Chen e Li (2009) também sugere que a concentração de oxigênio exerce maior influência na estabilidade do β-caroteno do que as temperaturas de aquecimento utilizadas. Bengtsson et al. (2008) demonstraram reduções, entre 20 – 30 %, nos níveis de carotenóides em batatas-doce em função dos tratamentos como cozimento em água, cozimento no vapor, fritura em óleo, desidratação em estufa e ao sol

Gama e Sylos (2007) investigaram o efeito da pasteurização e da concentração na composição de carotenóides em sucos de laranja ‘Valencia’, produzidos no Brasil. Durante a pasteurização a perda de carotenóides totais foi de 13 %, aumentando para 18 % após a concentração. Houve também perdas de violaxantina (38 %) e luteína (20 %) no suco pasteurizado. Zepka e Mercadante (2009) investigaram o efeito do aquecimento sobre carotenóides de suco de caju, demonstrando o aparecimento de isômeros cis e epóxidos, além do desaparecimento de algumas xantofilas durante o tratamento térmico, agravado ainda pelos ácidos presentes no suco. A utilização de temperaturas elevadas com tempos mais curtos melhorou a retenção de carotenóides, como demonstrado por Lin e Chen (2005a) que obtiveram melhor retenção de licopeno em sucos de tomate tratados por HTST (High-Temperature- Short-Time) a 121ºC por 40 segundos. O uso de novas tecnologias no processamento de sucos, como o tratamento em campo elétrico, em

substituição aos tratamentos térmicos convencionais, poderá auxiliar na manutenção das propriedades sensoriais e nutricionais do produto, inclusive no teor de carotenóides, como demonstrado por Odriozola- Serrano et al. (2009) em sucos de tomate e por Cortes et al. (2006) em sucos de laranja. O tratamento de sucos de laranja em coluna de pressão hidrostática também obteve resultados satisfatórios em relação à inativação enzimática, redução microbiana e retenção de carotenóides em estudo realizado por Sanchez-Moreno et al. (2003).

A desidratação é outra operação muito comum para frutas em geral, que também pode acarretar em perdas de carotenóides. Pinheiro Sant’Ana et al. (1998) relataram perdas de 35 e 38 % nos teores de β- caroteno e carotenóides totais, respectivamente, durante a secagem de cubos de cenoura em estufa com circulação de ar a 65ºC. Alguns autores propõem tratamentos prévios a secagem a fim de reduzir a degradação de carotenóides. Chen, Tai e Chen (2007) demonstraram que amostras de manga embebidas previamente por 30 minutos em soluções de ácido ascórbico 1 % e sulfito de sódio 1 % e depois desidratadas por ar quente ou liofilização, tiveram menores perdas de carotenóides quando comparadas com amostras sem tratamento prévio.

As condições de estocagem do produto e sua embalagem são outros pontos importantes para a estabilidade dos carotenóides nos alimentos. Lin e Chen (2005b) investigaram a estabilidade de carotenóides em suco de tomate armazenado em frascos de vidro, com e sem iluminação, e em latas, a temperaturas de 4ºC, 25ºC e 35ºC. Os três compostos analisados - luteína, licopeno e β-caroteno - apresentaram perdas em todas as amostras, mas essas foram maiores nos sucos armazenados em temperaturas mais elevadas, com exposição à luz e contato com oxigênio. Chen, Peng e Chen (1996) também já tinham relatado aumento nas perdas de luteína, α-caroteno e β-caroteno durante o armazenamento de sucos de cenoura pasteurizados, com o aumento da temperatura de estocagem e exposição à luz.

Porém, todos esses resultados devem ser interpretados com precaução. Estudos envolvendo a retenção de carotenóides em alimentos processados e/ou armazenados enfrentam dificuldades, como a falta de informações precisas do processamento ou das condições de estocagem, diferenças no processamento entre estudos, falta de especificação do cálculo de retenção ou perda, e a não correção ou compensação das perdas de massa durante o processamento e/ou estocagem, que levam a resultados que não representam a realidade. Os cálculos de retenção não levam em consideração as alterações de peso devido à perda de água (o que leva a concentração de nutrientes) ou ganho de água e gordura (o

que diluiria os nutrientes), podendo estimar para cima ou para baixo os valores reais de retenção. O simples cálculo em base seca também pode superestimar os valores de retenção. Por isso é recomendado que se leve em consideração no cálculo o ganho ou perda de massa durante o processamento e/ou armazenamento, ou realize-se todos os cálculos com base na massa do alimento cru (RODRIGUEZ-AMAYA, 1999; DE SÁ; RODRIGUEZ-AMAYA, 2004).

Em suma, condições necessárias para degradação dos carotenóides ocorrem durante a preparação, processamento industrial ou estocagem de alimentos. Neste sentido, medidas para aumentar a retenção de carotenóides, ou ainda, a adição destes compostos em alimentos processados, são alternativas importantes no estudo do processamento de um alimento (RODRIGUEZ-AMAYA, 1999).

3.2.3 Carotenóides em abóboras

A coloração da polpa da abóbora madura se deve principalmente a presença dos carotenóides, sendo o β-caroteno o composto majoritário na maioria dos casos. Outros carotenóides também são geralmente identificados, como luteína, α-caroteno e violaxantina (AZEVEDO- MELEIRO; RODRIGUEZ-AMAYA, 2007). Arima e Rodriguez-Amaya (1988) identificaram 14 carotenóides em C. moschata ‘Menina Brasileira’, 15 em C. maxima ‘Exposição’ e 17 no híbrido ‘Tetsukaboto’. Os mesmos autores em outro estudo identificaram 19 e 11 carotenóides em C. moschata ‘Baianinha’ e C. maxima ‘Jerimum Caboclo’, respectivamente (ARIMA; RODRIGUEZ-AMAYA, 1990). Matsuno et al. (1986) isolaram e elucidaram as estruturas de dois novos carotenóides, cucurbitaxantina A e cucurbitaxantina B, empregando ressonância magnética nuclear e espectrometria de massa.

A Tabela 2 reúne os resultados de alguns estudos envolvendo as concentrações de β-caroteno presente em abóboras. As comparações entre os valores citados e outros trabalhos disponíveis na literatura devem ser feita com cautela, pois como citado por Rodriguez-Amaya (1999; 2000) a composição pode ser afetada por uma série de fatores, como cultivar ou variedade, parte da planta em questão, estágio de maturação, clima ou geografia do local de produção, colheita e pós- colheita empregada, processamento, além da própria análise em si. Por isso, é comum encontrarmos valores tão diferentes até mesmo dentro de uma mesma espécie e variedade. Causas de variações também são discutidas por outros trabalhos envolvendo carotenóides (AZEVEDO- MELEIRO; RODRIGUEZ-AMAYA, 2005; RODRIGUEZ-AMAYA, 2008).

Tabela 2 Concentrações de β-caroteno (µg/g) em diferentes espécies de abóbora Espécie Variedade Origem β-caroteno Fonte

C. maxima Bischofsmutze Alemanha 4,7 1

C. maxima Halloween Alemanha 8,1 1

C. maxima Hokkaido I Alemanha 27,1 1

C. maxima Hokkaido II Alemanha 70,9 1

C maxima Uchiki Kuri Áustria 25,0 2

C. maxima Flat Whtie Boer Áustria 62,0 2

C. maxima Hyvita Áustria 25,0 2

C. maxima Buen Gusto Áustria 33,0 2

C. maxima Gelber Zentner Áustria 22,0 2 C. maxima Imperial Elite Áustria 74,0 2 C. maxima Jerimum Caboclo Brasil 21,0 3

C. maxima Exposição Brasil 15,4 4

C. maxima Exposição Brasil 17,0 5

C. moschata Muscade de Provence Alemanha 9,0 1

C. moschata Butternuts Alemanha 11,4 1

C. moschata Burpee Butterbush Áustria 31,0 2

C. moschata Long Islan Áustria 7,0 2

C. moschata Mousquée de Provence Áustria 49,0 2

C. moschata Menina Verde Brasil 39,0 5

C. moschata Baianinha Brasil 235,0 3

C. moschata Menina Brasileira Brasil 66,7 4

C. moschata Goianinha Brasil 56,7 4

C. pepo Sweet Lightning Alemanha 7,0 1

C. pepo Mogango Brasil 5,4 4

C. pepo Acorn Table Áustria 21,0 2

C. pepo Acorn Tay Bell Áustria 9,4 2

C. pepo Tonda Padana Áustria 23,0 2

Fonte: 1. Kurz, Carle e Schieber (2008); 2. Murkovic, Mulleder e Neunteufl (2002); 3. Arima e Rodriguez-Amaya (1990); 4. Azevedo-Meleiro e Rodriguez- Amaya (2007); 5. Arima e Rodriguez-Amaya (1988).

A comparação com outras fontes vegetais, demonstra que a abóbora pode ser considerada uma boa fonte de carotenóides da dieta. Por exemplo, Silva e Mercadante (2002) investigaram a composição de carotenóides do maracujá-amarelo in natura em cinco lotes. O β- caroteno, que foi o composto majoritário em dois dos cinco lotes, apresentou valores de concentração entre 4,48 e 13,35 µg/g.

Também para o β-caroteno, a polpa de manga da variedade ‘Keitt’ apresentou concentrações de 13,4 – 16,2 µg/g em estudo realizado por Mercadante, Rodriguez-Amaya e Britton (1997). Wilberg e Rodriguez-Amaya (1995) já tinham reportado o β-caroteno como principal pigmento em mangas, obtendo concentrações de 8,1 – 28,8 µg/g, dependendo da variedade e do método analítico.

Sentanin e Rodriguez-Amaya (2007) determinaram os teores de carotenóides de três cultivares de mamão (‘Sunrise’, ‘Golden’ e ‘Formosa’) e pêssego (‘Xiripá’, ‘Coral’ e ‘Diamante’). Em todas as amostras de mamões, o licopeno foi o composto majoritário, com valores de totais de 10,6 – 36,5 µg/g. O β-caroteno representou somente 4 % dos carotenóides totais, com concentrações entre 0,5 – 1,7 µg/g. Nas amostras de pêssego, a concentração de carotenóides foi considerada baixa, com valores de β-caroteno variando de traços até 0,5 µg/g. Wilberg e Rodriguez-Amaya (1995) estudaram os carotenóides majoritários de goiaba e mamão comercializados em supermercados do Rio de Janeiro. O licopeno foi o carotenóide majoritário, com concentrações de 44,8 – 61,0 µg/g na goiaba e 17,7 – 28,6 µg/g no mamão. As concentrações de β-caroteno, neste mesmo estudo, ficaram entre 3,02 – 5,84 µg/g e 0,80 a 1,76 µg/g, respectivamente.

Assim como no mamão e na goiaba, o licopeno também é predominante em tomates e derivados. Tavares e Rodriguez-Amaya (1994) encontraram teores médios de trans-licopeno de 31,03 µg/g em tomates comercializados no Brasil, com concentração média de trans-β- caroteno de 5,1 µg/g. Lin e Chen (2003) estudaram a composição de carotenóides em sucos de tomate, um produto que tem um alto consumo em Taiwan. As concentrações de licopeno e β-caroteno encontradas foram de 71,74 – 121,66 µg/g e 4,83 – 6,03 µg/g, respectivamente, com a variação dependente do solvente utilizado na extração. Lembrando que o licopeno, embora seja um composto importante, relacionado a possíveis reduções do risco de certos tipos de cânceres, não possui atividade de pró-vitamina A, como é o caso do β-caroteno.

Cereais como arroz, trigo, milho e sorgo também não podem ser considerados boas fontes de β-caroteno. Kandlakunta, Rajendran e Thingnganing (2008) encontraram valores de β-caroteno nos cereais

investigados que variaram desde 1,71 µg/g no milho até a não detecção destes compostos no arroz. Porém, outros carotenóides podem estar presentes. O milho, por exemplo, é uma boa fonte de luteína e zeaxantina (SCOTT; ELDRIDGE, 2005).

Outro vegetal relativamente comum na dieta brasileira e que apresenta altos teores de carotenóides totais e β-caroteno é a cenoura. Assim como a abóbora, a quantidade de carotenóides em algumas variedades de cenouras pode não ser tão elevada, porém em outras pode atingir concentrações como 180 µg/g de β-caroteno, podendo ser superior em alguns casos (RODRIGUEZ-AMAYA, 1997; RODRIGUEZ-AMAYA, 2008). O abricó também apresentou concentrações relativamente altas de β-caroteno, com valores próximos a 40 µg/g na variedade ‘Harogen’, em estudo realizado por Kurz, Carle e Schieber (2008).

A abóbora pode ser considerada uma boa fonte de carotenóides, e seus produtos podem contribuir para uma maior incorporação de carotenóides na dieta da população, especialmente os pró-vitamínicos α- e β-caroteno, trazendo benefícios para saúde e auxiliando na prevenção da hipovitaminose A.

3.2.4 Determinação de carotenóides

Com o aumento das pesquisas acerca das atividades biológicas e estabilidade dos carotenóides, houve a necessidade de um aprimoramento nas metodologias de análise destes compostos. Até o desenvolvimento da cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), a determinação de carotenóides era realizada por cromatografia de camada delgada ou de coluna aberta, que permanecem úteis em algumas análises. Porém, a utilização da CLAE representou um grande avanço neste sentido, pois aumentou o poder de resolução, reprodutibilidade e rapidez na separação, com menor exposição dos carotenóides a luz e ao oxigênio, diminuindo a degradação destes compostos durante o preparo da amostra. A determinação espectrofotométrica dos carotenóides totais é também usualmente utilizada por se tratar de um método simples, rápido e barato, porém se obtêm uma quantificação aproximada, podendo subestimar o conteúdo de carotenóides (LAGO, 2007; MELÉNDEZ-MARTÍNEZ; VICARIO; HEREDIA, 2007).

A análise de carotenóides geralmente envolve uma série de etapas, como tomada da amostra, extração, saponificação, análise cromatográfica, identificação e quantificação (MELÉNDEZ- MARTÍNEZ; VICARIO; HEREDIA, 2007). Contudo, devido à grande diversidade qualitativa e quantitativa de carotenóides entre as diferentes

matérias-primas, não há um método simples que possa ser aplicado em todos os casos onde se deseja identificar e quantificar esses compostos. Apesar dos principais passos serem semelhantes na maioria das vezes, cada método precisa ser adaptado em função do perfil de carotenóides e outras características da amostra em estudo (KIMURA et al., 2007). Devido aos problemas de estabilidade desses compostos, já discutidos anteriormente, também há várias medidas que devem ser adotadas em cada etapa durante a análise para reduzir a degradação e/ou isomerização dos carotenóides (RODRIGUEZ-AMAYA, 1999).

Com poucas exceções, carotenóides são compostos lipofílicos, sendo solúveis em solventes orgânicos, podendo ser extraídos com acetona, metanol, éter etílico, clorofórmio, acetato de etila, tetrahidrofurano (THF), entre outros. Para algumas matérias-primas é utilizada somente acetona. Além disso, outros solventes ou combinações podem ser utilizados, dependendo da amostra. Após a extração inicial, o extrato contém lipídeos polares contaminantes que podem ser removidos por partição, empregando um solvente apolar e água ou solução salina aquosa (RODRIGUEZ-AMAYA, 1999; OLIVER; PALOU, 2000).

Depois da extração há uma etapa de saponificação, que consiste no tratamento da amostra com uma solução alcalina, com o objetivo de liberar os carotenóides que se encontram esterificados com ácidos graxos.O grau de esterificação pode ser diferente em função do número de hidroxilas presentes nas xantofilas. Assim, carotenóides monohidróxi, como β-criptoxantina, podem ser encontrados livres ou esterificados por um ácido graxo, e diidroxicarotenóides, como luteína e zeaxantina, podem ser encontrados livres ou esterificados por um ou dois ácidos graxos. Essa complexidade de compostos dificulta a identificação dos picos no cromatograma, por isso muitos métodos empregam a saponificação. Além disso, a reação de saponificação normalmente leva a uma eliminação da clorofila que pode estar presente na amostra. A saponificação pode ser realizada overnight à temperatura ambiente ou sob aquecimento, com tempo reduzido de reação. Apesar da redução do tempo, o aquecimento aumenta o risco de isomerização, por isso o método à temperatura ambiente é mais utilizado, embora também cause perdas. É interessante destacar que, em alguns casos, a saponificação pode ser dispensada, como amostras ricas em carotenos e com baixas quantidades de xantofilas e clorofila, ou ainda, quando se deseja investigar a presença das formas esterificadas. Isso pode ser aplicado, por exemplo, a cenouras, tomates e algumas espécies de abóboras, onde a grande maioria dos carotenóides são carotenos e não contém grandes quantidades de clorofila e grupos esterificados. A

ausência da saponificação reduz as perdas de carotenóides durante o preparo da amostra por diminuir o tempo de análise e o contato com oxigênio e luz (OLIVER; PALOU, 2000; LARSEN; CHRISTENSEN, 2005;MELÉNDEZ-MARTÍNEZ; VICARIO; HEREDIA, 2007).

Para reduzir a oxidação durante a extração e tratamento da amostra, outra estratégia adotada é o uso de antioxidantes, especialmente quando as amostras são saponificadas. O antioxidante mais empregado é o butil hidroxi tolueno (BHT), normalmente na concentração de 0,01 % ou 0,1 % na solução de extração, mas também pode ser usado o ácido ascórbico ou seu sal sódico (OLIVER; PALOU, 2000). Além do emprego de antioxidantes, as operações devem ser realizadas com a menor intensidade de luz possível, normalmente utilizando vidro âmbar ou revestidos com folhas de alumínio (MELÉNDEZ-MARTÍNEZ; VICARIO; HEREDIA, 2007).

Após a saponificação, a amostra é concentrada em evaporador rotatório, utilizando baixas temperaturas, e a seguir seca com a utilização do nitrogênio. Uma vez secas, as amostras podem ser estocadas no escuro, a temperatura de -20ºC, preferencialmente com proteção de nitrogênio ou argônio (OLIVER; PALOU, 2000).

As amostras são ressuspensas em um solvente adequado e injetadas no cromatógrafo. Em relação à fase estacionária, as colunas de fase reversa C18 e C30 vêm sendo amplamente utilizadas para separação de carotenóides. Poucos estudos utilizam a fase normal. Em geral, melhores separações de carotenos e seus isômeros têm sido demonstradas com C18 poliméricas do que com monoméricas (SANDER; SHARPLESS; PURSCH, 2000). Sander et al. (1994) relataram que a coluna C18 monomérica não possibilitou uma boa separação de isômeros geométricos de carotenóides apolares e de luteína e zeaxantina, isômeros de posição. Nunes e Mercadante (2006) obtiveram uma boa separação entre luteína e zeaxantina utilizando essa mesma coluna, porém demonstraram que a coluna C30 polimérica mostrou maior poder de resolução tanto na separação dos isômeros 5- cis, 9-cis- e 13-cis-licopeno, quanto de luteína e zeaxantina. Os autores recomendam essa coluna quando o objetivo é investigar esses compostos em alimentos, apesar de advertirem para o elevado custo, no Brasil, da coluna e do éter metil-terc-butílico, que normalmente é utilizado na fase móvel. Além disso, caso o objetivo seja acompanhar as mudanças quantitativas nos carotenóides, é necessário atentar para problemas com a repetibilidade das áreas dos picos separados em coluna C30. Outros autores também relatam que a coluna C30 exibe uma resolução superior entre os carotenóides com polaridade similar quando

comparada com a C18, por isso são geralmente escolhidas quando se deseja fazer a separação de isômeros geométricos para estudo do perfil de carotenóides de uma amostra. Porém a coluna C18 apresentou uma separação relativamente boa entre os isômeros em algumas ocasiões (SCHIEBER; CARLE, 2005; MELÉNDEZ-MARTÍNEZ; VICARIO; HEREDIA, 2007).

Na fase móvel, gradientes de eluição aumentam a resolução do cromatograma, embora métodos isocráticos tenham certas vantagens como melhor reprodutibilidade de tempos de retenção e dispensar o reequilíbrio do sistema entre injeções consecutivas. Métodos isocráticos são muito úteis para a análise de carotenóides com atividade de pró- vitamina A, uma vez que a separação destes compostos é relativamente fácil e o tempo de análise é curto. Os métodos com gradientes permitem a separação de um maior número de compostos, sendo a opção de escolha quando se deseja estudar o perfil dos carotenóides. A adição de modificadores, como trietilamina, na fase móvel é muito utilizada, reduzindo o efeito de grupos ácidos da coluna que interferem na estabilidade dos carotenóides (MELÉNDEZ-MARTÍNEZ; VICARIO; HEREDIA, 2007). A escolha da coluna e da fase móvel são os principais fatores para o sucesso da separação e recuperação dos carotenóides (RODRIGUEZ-AMAYA, 1999).

O detector mais aplicado na separação de carotenóides por CLAE é o sistema de detector de arranjo de diodos (DAD), utilizado na maioria das publicações envolvendo a análise de carotenóides. Esse sistema permite registrar um espectro de absorção inteiro, na região do ultravioleta (UV) e do visível, durante a análise. Assim, o espectro de absorção de qualquer pico cromatográfico pode ser observado, o que é extremamente importante para a identificação do composto (OLIVER; PALOU, 2000). Com o espectro de absorção no UV/visível, é possível comparar os comprimentos de onda de máxima absorção (λ máx) e a estrutura fina do composto em questão com dados provenientes da literatura ou obtidos com padrões. Um indicativo da estrutura fina é expressa como %III/II, que é a razão da altura do pico de absorção mais longo, designado III, e o pico de absorção central, designado como II, tomando o mínimo entre os dois picos como linha base e multiplicando por 100 (Figura 6). Em algumas ocasiões, os isômeros cis são identificados pelo λ máx ligeiramente menor do que os obtidos para os