benzamidas ou seus fragmentos
Esquema 2.5. Síntese do complexo fac-[ 99m Tc{κ 3 H(μ-H)B(tim Me )(3,5-Me
2.2.2.2. Estabilidade in vitro
Os estudos de estabilidade in vitro indicam se os complexos de 99mTc têm a
capacidade de se manter intactos em condições aquosas e fisiológicas, o que é um requisito essencial para a sua utilização no desenvolvimento de radiofármacos. Por outro
lado, permitem prever a estabilidade dos complexos de 99mTc in vivo, face à reoxidação e
transquelatação do ligando por substratos biológicos que apresentem afinidade para o metal. Estes ligandos biológicos podem ser proteínas, aminoácidos ou outras moléculas presentes em circulação ou nos tecidos. Procedeu-se assim ao estudo da estabilidade in vitro do complexo Tc1 em condições fisiológicas (tampão fosfato salino (PBS), pH 7,4; 37 ºC) e através de ensaios competitivos com dois aminoácidos, a cisteína e a histidina (figura 2.11), que se encontram presentes em inúmeros tecidos biológicos e apresentam afinidade para a unidade fac-[99mTc(H
2O)3(CO)3]+.
Figura 2.11. Estrutura dos aminoácidos histidina e cisteína
O complexo Tc1 foi incubado em PBS, a pH 7,4 e a 37 ºC. A solução foi analisada por HPLC, ao fim de 24 h, verificando-se que o complexo Tc1 não sofreu reoxidação a [99mTcO
4]- ou outros processos de degradação. Em particular, confirmou-se que a ligação
Tc...H-B de Tc1 resiste às condições fisiológicas, como descrito previamente para compostos congéneres com boratos de bis(mercaptoimidazolilo).53
Nos ensaios competitivos com histidina e cisteína, utilizou-se uma concentração 10-5
M de cada aminoácido o que corresponde a uma razão molar 100:1 face à concentração de
Tc1, assumindo que se encontra presente em solução uma concentração 10-7 M de Tc. As
soluções resultantes foram analisadas por HPLC, ao fim de 1, 2, 4 e 6 h de incubação a 37 ºC, de modo a avaliar a eventual transformação de Tc1, nomeadamente através de processos de transquelatação. Os resultados obtidos encontram-se representados na figura 2.12.
Figura 2.12. Estabilidade do complexo Tc1 na presença de cisteína e histidina em PBS (pH = 7,4) a
37 ºC
O complexo Tc1 é instável na presença de histidina, verificando-se que apenas cerca de 30% do complexo inicial se encontra presente em solução ao fim de 6 h de incubação na presença deste aminoácido. A reactividade de Tc1 face à cisteína é menos acentuada, permanecendo intacto cerca de 80% do complexo após o mesmo tempo de incubação. Tal como Tc1, o composto fac-[99mTc{κ3-H(μ-H)B(timMe)
2}(CO)3]53 previamente
descrito também apresenta tendência para reagir com estes aminoácidos. No entanto, ao contrário do verificado para Tc1, este complexo apresenta uma reactividade mais acentuada face à cisteína comparativamente à histidina.53 Estes resultados reflectem
certamente as diferentes capacidades de coordenação dos sistemas de átomos doadores (κ3-H,S,N) e (κ3-H,S,S) face à unidade fac-[99mTc(CO)
3]+ e/ou diferenças de reactividade dos
boratos de bis(azolilo) coordenados face, por exemplo, a um eventual ataque do átomo de boro pelos aminoácidos.
2.2.2.3. Biodistribuição e estabilidade in vivo
A avaliação do comportamento biológico de complexos radioactivos em modelos animais é importante, pois permite estudar a selectividade e especificidade dos complexos para determinados órgãos ou tecidos alvos, possibilitando ainda a avaliação da velocidade de distribuição e eliminação. Através destes estudos é também possível avaliar a estabilidade dos complexos radioactivos in vivo, relativamente à reoxidação, hidrólise ou metabolização na presença de biomoléculas, tais como enzimas tecidulares ou em circulação. Em particular, permitem determinar a taxa de depuração sanguínea e identificar as vias de excreção envolvidas na eliminação do composto, parâmetros que são
0 2 4 6 0 20 40 60 80 100 Cisteína Histidina t (h) % T c 1
muito importantes na investigação e desenvolvimento de radiofármacos. De um modo geral, a depuração sanguínea deve ser rápida o suficiente para evitar irradiação excessiva do paciente, mas suficientemente lenta para permitir que o complexo radioactivo interaja com o seu alvo. Em relação às vias de excreção, a eliminação renal é vantajosa na medida em que geralmente é mais rápida e contribui para melhorar a razão alvo/fundo na região abdominal.
O comportamento biológico do complexo Tc1 foi estudado em ratinhos fêmea saudáveis Charles River da estirpe CD-1, a fim de avaliar a sua biodistribuição, farmacocinética e estabilidade in vivo. Os animais foram injectados com alíquotas de 100 µL (3,4-5,1 MBq) da solução de Tc1, por via intravenosa através da veia da cauda. Em seguida, os animais foram sacrificados a dois tempos diferentes (1 e 4 h p.i.) e os órgãos removidos, pesados e a sua actividade medida. Os resultados de biodistribuição foram calculados em percentagem de dose injectada por grama de órgão (% DI/g órgão) (tabela 2.5). A fixação de Tc1 nos órgãos mais relevantes é apresentada na figura 2.13.
Tabela 2.5. Resultados de biodistribuição (% DI g órgão) e excreção total (% DI) do complexo fac-
[99mTc{κ3-H(μ-H)B(timMe)(3,5-Me2pz)}(CO)3] (Tc1)
Orgão Tempo de Sacríficio
1h 4h Sangue 0,73 0,04 0,43 0,06 Fígado 25,5 2,2 20,4 3,9 Intestino 10,3 0,4 10,4 2,2 Baço 0,91 0,06 0,35 0,07 Coração 1,9 0,2 0,64 0,11 Rins 4,23 0,02 2,3 0,3 Músculo 2,2 0,4 1,0 0,2 Fémur 1,3 0,1 0,5 0,1 Estômago 1,3 0,4 0,9 0,5 Pâncreas 2,22 0,04 0,66 0,18 Cérebro 2,4 0,5 0,48 0,06 Olhos 0,73 0,04 0,15 0,02 Excreção (% DI) 4,16 3,68 7,5 0,7
0 5 10 15 20 25 30
Sangue Fígado Intestino Rim Músculo Estômago Cérebro
% D I / g o rg ão 1 h 4 h
Figura 2.13. Fixação (% DI/g órgão) nos órgãos/tecidos mais relevantes para o complexo Tc1
O complexo Tc1 apresenta uma depuração sanguínea relativamente rápida, como se pode verificar pelos valores de actividade presentes em circulação (% DI/g = 0,73 0,04, 1 h p.i.; 0,43 0,04, 4 h p.i.). A retenção no estômago é baixa o que indica que este composto não sofre reoxidação in vivo, visto que o [99mTcO
4]- apresenta uma elevada
afinidade para o estômago e tiróide.183 Não foi encontrada nenhuma fixação preferencial
em nenhum órgão ou tecido, excepto nos órgãos relacionados com as vias de excreção, como o fígado e intestinos e em menor grau os rins. Esta fixação hepática e intestinal indica que Tc1 deve ser excretado essencialmente por via hepatobiliar, reflectindo o seu carácter lipofílico. A excreção de Tc1 é muito lenta, tendo-se observado um valor de 7,5 0,7% DI às 4 h p.i. (tabela 2.5).
O complexo Tc1 apresenta a capacidade de atravessar a barreira hemato- enecefálica, com uma fixação cerebral inicial significativa (2,4 0,5% DI/g órgão, 1 h p.i.). Esta fixação diminui ao longo do tempo atingindo o valor de 0,48 0,06% DI/g órgão ao fim de 4 h p.i.. Um comportamento semelhante foi descrito anteriormente para os complexos fac-[99mTc(κ3-H(μ-R)B(timMe)
2(CO)3](R, H, Ph)53 o que indica que os complexos de 99mTc(I)
com boratos de bis(azolilo) apresentam em geral a capacidade para atravessar a barreira hematoencefálica. Esta capacidade reflecte certamente o seu carácter neutro e lipofílico e o seu peso molecular relativamente reduzido.
De modo a avaliar a estabilidade in vivo do complexo Tc1, procedeu-se à análise por HPLC de amostras de sangue e urina retiradas de ratinhos injectados (1 h p.i.) com o composto radioactivo (figura 2.14). Antes da análise por HPLC, a urina e o sangue foram
centrifugados, tendo-se ainda procedido à precipitação das proteínas plasmáticas do soro com etanol frio, procedimento que foi seguido para todos os estudos de estabilidade in vivo descritos nesta tese. Através do cromatograma apresentado na figura 2.14a, observa- se que a actividade em circulação corresponde quase exclusivamente ao complexo Tc1 (> 85%). Pelo contrário, a análise por HPLC da urina evidencia a presença de diferentes metabolitos, em percentagem claramente superior à de Tc1.
Figura 2.14. Cromatogramas de HPLC do a) sangue e b)urina de ratinhos injectados (1 h p.i.) com o
complexo Tc1
Como se pode verificar pela análise dos dados apresentados na figura 2.15, as características biológicas de Tc1 são muito menos favoráveis do que as descritas na literatura para os complexos modelo de 99mTc(I) (6 e 7) com ligandos do tipo pirazolo-
diamina e do tipo pirazolo-aminocarboxílico, as outras classes de ligandos bifuncionais que pretendíamos explorar, tal como discutido na introdução deste capítulo.51,54 Como visto
atrás, o complexo Tc1 apresenta uma excreção lenta (inferior a 10% DI às 4 h p.i.) e uma elevada retenção no fígado. Pelo contrário, os complexos modelo 6 e 7 apresentam taxas de excreção relativamente elevadas (superiores a 30% DI à 1 h p.i.) e uma eliminação rápida dos órgãos não-alvo, características favoráveis para o desenvolvimento de radiofármacos específicos para detecção tumoral.
0 10 20 30 40 50 60 1 h 4 h 1 h 4 h 1 h 4 h
%
D
I
/
g
or
gã
o
t (h) Sangue Músculo Rim Intestino Fígado % Excreção total (% DI)Figura 2.15.Comparação dos resultados de biodistribuição mais relevantes (% DI/g órgão) e
excreção total (% DI) dos complexos modelo Tc1, fac-[99mTc(CO)3{3,5-Mepz(CH2)2NH(CH2)2NH2}]+ (6) 51 e fac-[99mTc(CO)3{3,5-Mepz(CH2)2NHCH2COO}] (7) 54 em ratinhos fêmea CD1
Perante estes resultados e contrariamente ao previsto inicialmente, não se utilizou a estrutura do complexo Tc1 para funcionalização com derivados das benzamidas ou seus fragmentos, tendo em vista obter complexos de 99mTc relevantes como sondas radioactivas
para detecção do melanoma melanótico. Para atingir este objectivo, prosseguiu-se unicamente com a funcionalização de ligandos do tipo pirazolo-diamina e do tipo pirazolo- aminocarboxílico com derivados das benzamidas ou seus fragmentos, como descrito a seguir.