BSA INDUZIDOS POR SURFACTANTES ANIÔNICOS
3.3 Resultados e Discussão
3.3.1 Estado conformacional e oligomérico da BSA no pH 3.7: SAXS, SRCD e MD
É bem conhecido que a proteína BSA pode alterar a sua conformação em função de mudan- ças de pH [52]. Em pH 6,5 (fig. 3.8A) os três domínios principais da proteína estão dispostos em forma de coração contando com 17 pontes dissulfeto que estabilizam esta conformação. Com a diminuição do pH abaixo do seu ponto isoelétrico a BSA expande-se parcialmente podendo atingir a sua conformação totalmente expandida em pH 2,7 [52]. Realizamos simulações de dinâmica molecular para descrever a conformação da proteína em pH 3,7 (fig. 3.8B) como um recurso para a análise de dados experimentais de SAXS. Além disso, um dímero (fig. 3.8C) foi também obtido através de modelagem de corpo rígido utilizando o software GLOBSYMM [92, 93] tendo em vista que as análises das curvas experimentais de SAXS indicaram a presença de um oligômero em solução.
Figura 3.8: Estrutura cristalográfica da BSA extraída do PDB 4F5S a pH 6,5 [54](A), monômero obtido por MD ao baixar o pH para 3,7 (B) e dímero obtido por modelagem de corpo rígido usando (B) como monômero (C). Representado em azul é o domínio I, verde o domínio II e laranja o domínio III.
A medida que a proteína se desenovela esperar-se-ia um aumento de área superficial exposta ao solvente. De fato, a análise de MD apresentada na figura 3.9 confirma o aumento
médio de área acessível ao solvente (SASA) por resíduo e a raiz quadrada do desvio médio (RMSD) de posições atômicas por resíduo do monômero parcialmente desenovelado em relação à conformação enovelada (PDB 4F5S) para cada domínio. Para todos os domínios houve um aumento em SASA e deslocamento na posição média dos resíduos em relação às posições originais (conformação dobrada). A distância média entre os resíduos do domínio I (D1) e domínio III (D3) (azul e laranja na figura 3.8, respectivamente) é semelhante (15 Å/ por resíduo - quadrado e triângulo na figura 3.9, respectivamente) e quase duas vezes maior do que o registrado para o domínio D2 (6 Å/ por resíduo - cor verde na figura 3.8 e círculo na figura 3.9). O inverso ocorreu para o aumento de SASA, ou seja, para o D2 o aumento de área acessível ao solvente foi quase duas vezes maior do que o encontrado para os domínios D1 e D3 (figura 3.9). Estes resultados sugerem que, embora os domínios D1 e D3 tenham se movido para longe da posição original, eles mantiveram uma conformação enovelada. Por outro lado, a separação dos domínios D1 e D3 do domínio D2 causou uma exposição dos resíduos que estavam “enterrados” entre os domínios o que resultou no aumento de SASA para o D2. Curiosamente, Baler et al. [75] também demonstraram que o domínio D2 é o mais exposto após a diminuição do pH. Importante acrescentar que uma carga positiva líquida de +99 para a BSA foi obtida na configuração por MD, o que está em boa concordância com o valor de +100 a pH 3,5 reportado por aqueles autores [75].
Figura 3.9: Análise de MD para o aumento médio de SASA por resíduo de BSA em função de RMSD por resíduo após a diminuição do pH de 6,5 para 3,7 para o domínio I (resíduos 1-185, quadrado), II (resíduos 186-378, círculo), III (resíduos 379-576, triângulo). Os valores de referência SASA e RMSD utilizados na comparação foram obtidos para a BSA (PDB 4F5S) a pH 6,5.
Entretanto, a conformação parcialmente desenovelada reportada por Baler et al [75] é mais expandida do que a encontrada aqui (fig. 3.8B). Este fato provavelmente reflete a pressão constante aplicada durante nossas simulações (ensemble NpT), que pode restringir o movimento dos átomos, enquanto Baler et al [75] utilizaram um ensemble NVT, que pode permitir aos átomos alcançarem maiores distâncias a partir das posições originais.
Curiosamente, os resultados de MD não indicaram qualquer alteração no conteúdo de estrutura secundária de α-hélices causado pela diminuição do pH 6,5 para 3,7. Isto está em acordo com os nossos dados de SRCD de BSA a pH 3,7 em 50 mM de solução tampão de glicina, que resultou em 64% α-hélice em meio ácido (ver fig 3.19). Cabe acrescentar que, a glicina, como osmólito, manteve a estrutura secundária inalterada, o que era esperado, pois essa classe de moléculas é conhecida pela sua capacidade de estabilizar a conformação enovelada de proteínas [109–111].
A figura 3.10 apresenta os dados experimentais de SAXS (símbolos vazios) obtidos para a amostra de 1 mg/mL de BSA (15 µM) em solução tampão de glicina 50 mM a pH 3,7 juntamente com a curva teórica (linha verde) calculada a partir da proteína parcialmente desenovelada, prevista por MD e a partir do dímero (linha roxa) obtido por modelagem de corpo rígido, a pH 3,7 (representadas na fig. 3.8 B e C, respectivamente). A curva teórica calculada a partir do estado enovelado da BSA nativa (PDB 4F5S) também está incluída na figura 3.10 para efeitos de comparação (linha azul).
Como se pode ver, nenhuma das curvas calculadas a partir das estruturas atômicas se ajusta bem aos dados experimentais. No entanto, a conformação parcialmente desenovelada consegue representar os dados experimentais entre 0,04 Å-1e 0,35 Å-1 mas não consegue reproduzir os dados para valores de q menores do que 0,04 Å-1.
As funções de distribuição de distâncias (p(r)) correspondentes às curvas de SAXS da figura 3.10 são apresentadas na figura 3.11. Todas as funções p(r) exibem características semelhantes: a frequência máxima de distâncias ocorre em torno der = 40 Å com a distância máxima (Dmax) = 80 Å, 100 Å e 150 Å para configurações nativa, parcialmente desenovelada e para o dímero, respectivamente. É interessante notar que esses valores estão em acordo com as estruturas atômicas apresentadas na figura 3.8.
Figura 3.10: Curva de SAXS para a BSA (1 mg/mL) em pH 3.7 (símbolos vazios) juntamente com curvas de SAXS calculadas para as estruturas apresentadas na figura 3.8: PDB 4F5S [54] (linha azul), monômero parcialmente desenovelado obtido por MD em pH 3.7 (linha verde), dímero obtido por modelagem de corpo rígido a pH 3,7 (linha roxa) e o melhor ajuste (linha vermelha) calculado pelo software GENFIT como sendo composto por 75% de espécies monoméricas parcialmente desenoveladas a pH 3,7 e 25% do respectivo dímero (fig. 3.8C). Inserido no gráfico estão as mesmas curvas, em escala linear.
Figura 3.11: Funções de distribuição de distâncias (p(r)) das curvas de SAXS da BSA apresenta- das na figura 3.10 utilizando o mesmo código de cores: PDB 4F5S [54] (linha azul), monômero parcialmente desenovelado obtido por MD em pH 3.7 (linha verde), dímero obtido por mo- delagem de corpo rígido a pH 3,7 (linha roxa) e o melhor ajuste (linha vermelha) calculado pelo software GENFIT como sendo composto por 75% de espécies monoméricas parcialmente desenoveladas a pH 3,7 e 25% do respectivo dímero (fig. 3.8). Os símbolos pretos vazios representam a função p(r) dos dados experimentais calculados pelo software GIFT - modelo independente - e a linha vermelha é a função p(r) calculada a partir do ajuste mencionado acima. O gráfico inserido mostra o bom ajuste entre as curvas de espalhamento e o ajuste utilizado para calcular a função p(r) usando o software GIFT em todos os casos.
Além disso, sabe-se bem que o valor de I(0) está diretamente relacionado com a massa molecular da proteína e, consequentemente, ao seu estado oligomérico em solução [81]. Assim, o aumento da intensidade de espalhamento para valores deqpequenos em relação ao previsto para o estado monomérico da BSA (figura 3.10) indica que monômeros de BSA a pH 3,7 coexistem com agregados de ordem maior em solução. De fato, por extrapolação da curva experimental utilizando a análise de Guinier [81] obteve-se uma massa molecular (MM) de 87 (2) kDa, que é 35% maior que o esperado para a MM do monômero (ver tabela 3.1), sugerindo que a BSA em solução encontra-se em equilíbrio, com monômeros parcialmente desenovelados (fig. 3.8B) e agregados.
PDB 4F5S Parc. Desenovelada Dímero Ajuste Guinier
MM (kDa) 64,4 64,4 128,8 90(2) 87(2)
Rg (Å) 26,9 32,0 49,2 39(1) 39(1)
Tabela 3.1: Massa Molecular (MM) e o raio de giro (Rg) para a estrutura cristalográfica de BSA a pH 6,5 (PDB 4F5S [54]), conformação parcialmente desenovelada obtida em nossas simulações de MD; dímero obtido por modelagem de corpo rígido utilizando o software GLOBSYMM a pH 3,7; ajuste calculado utilizando o software GENFIT como sendo composto por 75(5)% do monômero parcialmente desenovelado a pH 3,7 e 25(5)% respectivo dímero; Guinier fornece os valores de MM e Rg calculados diretamente da curva experimental (eq. Guinier 3.8).
Deste modo, procedeu-se a análise dos dados de SAXS supondo que os dados experimentais têm uma contribuição do espalhamento do monômero parcialmente desenovelado a pH 3,7 obtido por MD e do dímero modelado por corpo rígido utilizando o programa GLOBSYMM [92, 93] composto por dois monômeros a pH 3,7 (fig. 3.8B e C). Portanto, a linha vermelha na figura 3.10 representa o melhor ajuste aos dados experimentais, evidenciando que cerca de 75% de monômeros de BSA parcialmente desenovelados coexistem com aproximadamente 25% de dímero (tabela 3.1). Curiosamente, Yeh et al. [112] também sugeriram uma coexistência entre monômeros (82%), dímeros (16%) e oligômeros (2%) de BSA a pH semelhante, avaliada por cromatografia líquida de alta eficiência. Além disso, os autores calcularam um raio de giro médio de 38 Å [112], muito semelhante ao valor obtido nesta tese.
Assim sendo, demonstramos através de análises de SAXS que a isoforma de BSA parcial- mente estendida prevista por simulação de MD a pH 3,7 tem a tendência para se agregar como um dímero, apesar do fato de ela adquirir uma grande carga líquida superficial positiva (+99). Isto deve acontecer devido ao aumento na área de superfície hidrofóbica e hidrofílica expostas ao solvente (fig 3.12) ao se reduzir o pH de 6,5 para 3,7. Estas observações estão de acordo com resultados anteriores de MD de BSA em pH 3,5 [75] onde os autores evidenciaram um aumento de SASA hidrofóbica para os três domínios, expondo assim aminoácidos mais hidrofóbicos ao solvente. A exposição da superfície hidrófobica (apresentada neste trabalho e em [75]) favorece a dimerização de BSA.