SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO
3. MATERIAL E MÉTODOS
4.2 ESTIMATIVAS DE FRAUDES COMERCIAIS
Do total de 92 amostras coletadas em restaurantes, 75 amostras apresentaram bons resultados na amplificação e purificação, sendo encaminhadas para o sequenciamento, assim como 4 amostras foram repetidas sem purificação, totalizando 79 amostras sequenciadas (Tabela 1).
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Tabela 1: Identificação comparativa considerando o nome declarado das espécies comercializadas e a espécie identificada por Barcode no BOLD e no BLAST. Todas as espécies obtiveram níveis de similaridade maior ou igual a 98%, indicando que a amostra testada pertence à espécie identificada (Identidade 98%), com exceção das espécies cujo Nome popular está marcado com asterisco (*), onde os valores foram inferiores ao mínimo desejado (Identidade < 98%) e NI – não identificadas, nas quais não houve associação entre a sequência e nenhum dos bancos de dados.
ID Nome popular Espécie atribuída1 Espécie BOLD2 Espécie BLAST2 Nome popular3
RES001 Atum Thunnus sp. Thunnus obesus Thunnus obesus Atum
RES002 Atum Thunnus sp. Thunnus obesus Thunnus obesus Atum
RES003 Atum Thunnus sp. Thunnus obesus Thunnus obesus Atum
RES004 Atum Thunnus sp. Thunnus obesus Thunnus sp. Atum
RES005 Atum Thunnus sp. Seriola lalandi Seriola lalandi Olhete
RES006 Atum Thunnus sp. No match Seriola lalandi Olhete *
RES007 Atum Thunnus sp. Lepidocybium flavobrunneum Lepidocybium flavobrunneum Escolar-preto
RES008 Atum Thunnus sp. Lepidocybium flavobrunneum Lepidocybium flavobrunneum Escolar-preto
RES009 Atum Thunnus sp. Seriola zonata Seriola lalandi Olhete
RES010 Atum Thunnus sp. Thunnus obesus Thunnus obesus Atum
RES011 Atum Thunnus sp. Thunnus obesus Thunnus tonggol Atum
RES012 Atum Thunnus sp. Salmo salar Salmo salar Salmão
RES013 Atum Thunnus sp. Thunnus alalunga Thunnus alalunga/ T. orientalis Atum
RES014 Atum Thunnus sp. Salmo salar Salmo salar Salmão
RES015 Atum Thunnus sp. Thunnus obesus Thunnus obesus Atum
RES016 Atum Thunnus sp. Thunnus obesus Thunnus obesus Atum
RES017 Atum Thunnus sp. Thunnus obesus Thunnus obesus Atum
RES018 Atum Thunnus sp. Thunnus obesus Thunnus obesus Atum
RES019 Dourado Coryphaena hippurus Coryphaena hippurus No significant similarity found. Dourado
RES020 Espada Trichiurus lepturus Xiphias gladius NI Espadarte
RES021 Linguado Paralichthys orbignyanus Paralichthys orbignyanus Paralichthys orbignyanus Linguado
RES022 Linguado Paralichthys orbignyanus Paralichthys orbignyanus Paralichthys orbignyanus Linguado
RES023 Olhete Seriola sp. No match Lepidocybium flavobrunneum Escolar-preto*
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RES025 Olhete Seriola sp. Seriola zonata Seriola zonata Olhete
RES026 Peixe Branco - Salmo salar Salmo salar Salmão
RES027 Peixe Branco - Seriola zonata Seriola lalandi Olhete
RES028 Peixe Branco - Salmo salar Salmo salar Salmão
RES029 Peixe Branco - No match Thunnus sp Atum*
RES030 Peixe Branco - Seriola zonata Seriola lalandi Olhete
RES031 Peixe Branco - No match Salmo salar Salmão*
RES032 Peixe Branco - Salmo salar Salmo salar Salmão
RES033 Peixe Branco - Oreochromis sp. Oreochromis niloticus Tilápia do Nilo
RES034 Peixe Branco - Coryphaena hippurus NI Dourado
RES035 Peixe Branco - Coryphaena hippurus NI Dourado
RES036 Prego Lepidocybium flavobrunneum Lepidocybium flavobrunneum Lepidocybium flavobrunneum Peixe prego
RES037 Prego Echinorhinus brucus Ruvettus pretiosus NI Anchova negra
RES038 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES039 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES040 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES041 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES042 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES043 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES044 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES045 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES046 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES047 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES048 Salmão Salmo salar Seriola zonata Seriola zonata Olhete
RES049 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES050 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES051 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES052 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES053 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES054 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES055 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
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RES057 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES058 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES059 Salmão Salmo salar no match Oncorhynchus kisutch Salmão-prateado*
RES060 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES061 Salmão Salmo salar No match Salmo salar Salmão*
RES062 Salmão Salmo salar No match No match NI
RES063 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES064 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES065 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES066 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES067 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES068 Salmão Salmo salar Thunnus alalunga Thunnus alalunga Atum
RES069 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES070 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES071 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo trutta Salmão
RES072 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES073 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES074 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES075 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES076 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES077 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES078 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão
RES079 Tilápia Oreochromis niloticus Oreochromis sp. Oreochromis sp. Tilápia vermelha
Fonte: Elaborado pela autora, 2015.
1. Nome popular e científico, respectivamente da amostra conforme obtido no momento da coleta; A ausência de nome científico indica que pode
tratar-se de uma variedade de espécies.
2. Nome científico da espécie cujas sequências depositadas nos bancos de dados retornaram a maior similaridade com a sequência obtida na análise.
3. Nome popular atribuído à espécie identificada na análise, de acordo com o banco de dados FISHBASE (www.fishbase.org) e identificação taxonômica de especialista.
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Em todos os casos durante a comparação das sequências obtidas com as sequências dos bancos de dados BOLD e GenBank foi adotado o critério do BOLD para identificação das amostras em nível específico, o qual considera no máximo 2% de divergência genética.
A identificação por DNA Barcode indicou que, entre as amostras sequenciadas de salmão, grupo com maior amostragem (n=41), foram identificadas as espécies Salmo salar – salmão (n=35), Seriola zonata – olhete (n=1) e Thunnus alalunga – atum (n=1) e 4 não apresentaram resultados quando comparadas aos bancos de dados (Gráfico 1).
Gráfico 1: Distribuição das amostras de salmão coletadas em restaurantes e os resultados após sequenciamento.
Fonte: Elaborado pela autora, 2015.
As amostras de Thunnus sp. – Atum (n=18), apenas 11 foram identificadas sem substituições sendo que as demais não eram correspondentes com a espécie comercializada, sendo substituídas por: Seriola. lalandi (n=2), Lepidocybium flavobrunneum – peixe-prego (n=2) e S. salar (n=2), totalizando 6 substituições. Uma amostra não apresentou resultados quando comparado aos bancos de dados (Gráfico 2). 41 Amostras de Salmão Salmões não fraudados Fraudes No match
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Gráfico 2: Distribuição das amostras de atum coletadas em restaurantes e os resultados após sequenciamento.
Fonte: Elaborado pela autora, 2015.
Para o grupo genericamente identificado como Peixe Branco (n=20) foram detectadas 3 substituições, todas por S. salar (Gráfico 3).
Gráfico 3: Distribuição das amostras de peixe branco coletadas em restaurantes e os resultados após sequenciamento.
Fonte: Elaborado pela autora, 2015.
18 Amostras de Atum
Atuns não fraudados Fraudes
No match
20 Amostras de Peixes Branco
Peixes Branco não fraudados Fraudes
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5. DISCUSSÃO
5.1 OTIMIZAÇÃO DOS PROTOCOLOS
Para a realização da maioria das metodologias de biologia molecular, o primeiro passo é a extração dos ácidos nucleicos (DNA e RNA), obtidos a partir de vários tipos de tecidos e células. A definição do melhor protocolo de extração de DNA dependerá de diversos fatores como, o tipo de tecido, o grau de integridade e pureza do DNA para a PCR, sequenciamento, clonagem ou outra utilização do mesmo (GOUVEIA & REGITANO, 2007).
Comparando os três métodos (Salting Out, HotShot e Salting Out com banho maria), verificou-se que os protocolos utilizados possuem validade para a extração de DNA mitocondrial de peixes, demostrando assim a eficiência dos mesmos. Apenas o protocolo Salting Out com banho-maria apresentou alguns rastros devido a maior concentração proteica, porém levando em consideração o número de amostras que apresentaram resultados positivos e avaliando o tempo gasto para a execução dos protocolos. No presente trabalho foi adotado o protocolo Salting Out, que apresentou os melhores resultados nos testes, e foi usado para as extrações das amostras subsequentes. Outros trabalhos testaram os protocolos de Fenol-Clorofórmio, Cloreto de Sódio e Acetato de Amômia (GARCIA et al., 2010). Parpinelli e Ribeiro (2009) analisaram três protocolos de extração de DNA (Fenol-Clorofórmio, NaCl e Brometo de Cetiltrimetilamônio – CTAB) e verificaram que os melhores resultados para o método de extração através do protocolo Fenol-Clorofórmio. Halfen et al. (2012) também realizou testes para a obtenção do DNA genômico utilizando os protocolos descritos por Bardakci & Skibinski (1994), cuja as otimizações tornaram a técnica menos laboriosa e mais econômica, bem como os protocolos descritos por Miller et al. (1988) e Wasko et al. (2003), cuja a combinação entre as três técnicas preserva a integridade do DNA diminuindo o uso de substâncias agressivas.
Para a Reação da Polimerase em Cadeia – PCR foram testadas a Taq DNA Polimerase e a Taq DNA Polimerase Platinum, enzimas termoestáveis, utilizadas na amplificação de fragmentos de DNA, suportando elevadas temperaturas. É importante assegurar a atividade da polimerase durante as condições operacionais, a taxa de extensão depende fortemente dos meios de reação e do DNA-molde. Outra característica necessária é que a DNA Polimerase não se dissocie do DNA quando translocada para outra posição: DNA polimerases eficientes possuem alta fidelidade, inserindo o nucleotídeo correto à fita
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em extensão (LUDWIG, 2010; PAVLOV et al., 2004). Para este trabalho os resultados revelaram maior fidelidade na incorporação dos nucleotídeos com o uso da Taq DNA Polimerase Platinum, composta por anticorpos específicos que inibem a atividade da polimerase em temperatura ambiente. Esta polimerase só é ativada durante o início da PCR a 94ºC (lifetechnologies.com), possibilitando a amplificação da região gênica de interesse com bons resultados quando comparado com a Taq DNA Polimerase. Com relação à necessidade ou não de purificação do DNA isolado (remoção de proteínas, polissacarídeos e outros contaminantes da amostra), os resultados evidenciaram que este procedimento é essencial para a manutenção da qualidade, para que as impurezas não interfiram, garantindo assim a qualidade das sequências produzidas. Segundo Figueiredo et al., (2003) a purificação representa 2% do valor total de uma placa sequenciada, sendo assim um passo indispensável para produzir sequencias com qualidade, além de promover a preservação dos capilares do sequenciador automático do DNA.
5.2 ESTIMATIVAS DE FRAUDES COMERCIAIS
Adotando o critério do BOLD, de que indivíduos da mesma espécie apresentam no máximo 2% de divergência em suas sequências (RATNASINGHAM & HEBERT, 2007), comparando o resultado do banco de dados obtido com aqueles do BOLD e GenBank, 7 amostras apresentaram inconsistências.
As pescarias oceânicas de grandes peixes pelágicos apresentam elevada importância econômica e social, os peixes capturados alcançam altos preços no mercado internacional, sendo muito explorados. Várias espécies (Thunnus albacares, T. atlanticus, T. obesus e T. orientalis) são vendidas pelo nome popular de atum enão se caracteriza como fraude (NETO, 2013). Entretanto, como citado neste trabalho, de todo o atum produzido em Santa Catarina, 90% é enviado para São Paulo (SINDIPI, 2012), o que provoca baixa disponibilidade de atuns no mercado catarinense. Este fato possibilita substituições quando os peixes não são vendidos inteiros ou muitas vezes são previamente manipulados com a utilização de corantes. As espécies comercializadas como atum que neste trabalho foram detectadas substituições são: S. salar, L. flavobrunneum e Seriola sp..
Autores relataram casos de substituições de atum por peixe- prego, porém como este nome popular é utilizado para pelo menos duas espécies (L. flavobrunneum e Ruvettus pretiosus) em alguns países é proibida a comercialização de ambos devido à constatação de problemas
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relacionados à segurança alimentar (FOOD SAFETY, 2011; FELDMAN et al., 2004). O peixe olhete apresenta um filé de coloração semelhante ao atum (Figura 4), porém seu preço de mercado é bem mais acessível o que justifica as fraudes na intenção de um ganho financeiro ilícito. Por outro lado, a substituição por salmão ocorre devido à adição de corantes junto à ração dos peixes criados em cativeiro (BJERKENG, 2000), a qual pode enganar o consumidor final.
Figura 4: Semelhanças físicas entre filés de olhete (1) e/ou filés de atum (2).
Fontes: sushialacarte.com.br e gourmetsan.com.br
O salmão é um peixe de alto valor comercial, o que facilita as substituições fraudulentas no comércio de pescados, principalmente devido à falta de rigor na fiscalização (NETO, 2013). No presente estudo foi verificada uma substituição por peixe de menor valor comercial, no caso o olhete. Intrigantemente verificou-se também substituição por um peixe de valor comercial maior ou semelhante, no caso o atum. Estas substituições podem ocorrer quando peixes filetados recebem a adição de corantes, ou com o uso de rações enriquecidas com corantes, mascarando assim sua verdadeira identificação (BEHS, 2011). Peixes de águas frias, como o atum e o salmão, são as melhores fontes de ácidos graxos poli-insaturados ômega 3 (BEHS, 2011), quando estes são substituídos por outras espécies, o consumidor é enganado e o seu direito ao acesso à alimentos de qualidade é negado.
Nos restaurantes de culinária japonesa, muitos peixes são chamados genericamente de “peixe branco”, podendo ser peixe-prego, olhete, robalo, tilápia, dourado, espada, linguado, entre outros. Com a remoção de caracteres morfológicos de peixes processados, isso inviabiliza a correta identificação dos mesmos. Outro problema é o uso do mesmo nome popular para muitas espécies, como por exemplo, L. flavobrunneum e R. pretiosus que em muitas regiões são conhecidos como peixe-prego, o que causa preocupação, pois a utilização do mesmo nome popular dificulta a correta identificação das espécies (ARDURA et al., 2010; CAWTHORN et al., 2012), podendo ocasionar danos à saúde humana.
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Também há espécies que, devido a sua morfologia semelhante, são identificados no momento da captura de maneira errônea como por exemplo o peixe-espada – Trichiurus lepturus e o espadarte – Xiphias gladius que, ocasionalmente, é chamado de peixe-espada, porém ambos são considerados como peixes-de-bico e são pescados da mesma maneira que os atuns (OLAVO et al., 2005; ENCICLOPÉDIA ESCOLAR BRITANNICA, 2015).
Carvalho et al., 2014 mostraram que em Florianópolis ocorreram substituições na comercialização de peixes considerados nobres por outros de menor valor. Outros trabalhos no Brasil e exterior também demostraram este tipo de substituição (CARVALHO et al., 2011; WONG & HANNER, 2008; FILONZI et al., 2010). O que chamou a atenção no presente trabalho foi a identificação de peixes brancos identificados como salmão: uma vez que esta espécie é criada em cativeiro muitas vezes os corantes não são adicionados a dieta alimentar dos mesmos ou quando é, a absorção é diferenciada entre os indivíduos (ARGENTA, 2007) (Figura 5). Isso resulta na carne branca de alguns salmões os quais são vendidos como peixe branco, facilitando assim substituições fraudulentas, porém não fazendo sentido financeiro aos comerciantes.
Figura 5: Comparação de diferentes filés de salmão tratados com pigmentos carotenóides.
Fonte: ARGENTA (2007).
A imprecisão na identificação das espécies ou o uso exclusivo das características morfológicas, pode significar limitações na identificação, principalmente quando há apenas um fragmento de uma espécie (RIBEIRO et al., 2012). Vários autores, norte americanos, canadenses, italianos, entre outros, relataram substituições quando analisaram várias espécies de peixes (BAKER, 2008; WONG & HANNER, 2008; LOWENSTEIN et al., 2009; LOWENSTEIN et al., 2010; FILONZI et al., 2010; CAWTHORN et al., 2012). No Brasil o caso mais conhecido é o que descreve substituições em Surubins (Pseudoplatystoma sp.), descrito por Carvalho et al. (2011). Em Florianópolis foram detectadas substituições em bacalhau, congrio rosa comercializados em
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supermercados e linguados servidos em restaurantes (CARVALHO et al., 2014).
A técnica do DNA Barcode é suficiente para a identificação de espécies de peixes (HEBERT et al., 2003, 2004; SMITH et al., 2008) e os resultados do presente estudo reforçam a eficiência da técnica, demonstrando assim a necessidade de mecanismos regulatórios que auxiliem a reduzir práticas ilícitas de substituições de espécies. Os consumidores precisam de informações claras e precisas na hora de fazer as escolhas alimentares, a identificação dos peixes deve ser autêntica e não enganosa (LOBO et al., 2014), permitindo que os consumidores não sejam lesados por essa prática e façam escolhas conscientes.
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6. CONCLUSÃO
As técnicas usadas nos protocolos de extração de DNA foram otimizadas, sendo o método de extração de DNA Salting Out, juntamente com o uso da Taq DNA Polimerase Platinum e a purificação das amostras as técnicas que apresentaram os melhores resultados.
O presente trabalho corrobora a eficiência do DNA Barcode na identificação de peixes. As comparações das sequências das amostras coletadas em restaurantes de culinária japonesa com os bancos de dados BOLD Systems e GenBank demonstram alta sensibilidade, especificidade e confiabilidade nos resultados.
O peixe com maior evidência de substituições fraudulentas em restaurantes de culinária japonesa de Florianópolis foi o atum.
Devido à presença de substituições e a popularização dos restaurantes de culinária japonesa, são necessários mecanismos regulatórios e o desenvolvimento de estratégias para autenticar a identificação das espécies comercializadas, sendo o DNA Barcode uma opção confiável baseada em resultados científicos.
É de extrema importância efetivar parcerias realizadas entre órgãos de fiscalização e instituições de ensino para coibir as práticas ilícitas, reduzindo a taxa de fraude, garantindo assim a transparência no comércio de produtos de peixe, para que o consumidor não seja lesado.
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