Introdução
O termo proteína bruta (PB) envolve grande grupo de substâncias com estruturas semelhantes, porém com funções químicas e fisiológicas diferentes. Baseado no fato de as proteínas terem percentual de nitrogênio aproximadamente constante (em torno de 16%), procede-se à sua avaliação indireta por intermédio da concentração de nitrogênio no material e utilizando-se o fator de conversão 6,25 para a conversão do resultado em equivalentes protéicos (Silva & Queiroz, 2002).
O método mais utilizado no Brasil foi proposto por Kjeldahl na Dinamarca em 1883, quando estudava proteína em grãos. Este apresenta três etapas distintas: digestão, destilação e titulação. A digestão baseia-se no aquecimento da amostra em ácido sulfúrico até que os compostos orgânicos sejam oxidados. O nitrogênio da proteína (orgânico) é reduzido e transformado em sulfato de amônia (inorgânico) que é uma substância estável (Pomeranz & Meloan, 1978), porém não facilmente quantificável. Nessa etapa utiliza-se uma mistura digestora, composta de um sal (sulfato de sódio ou de potássio) com a finalidade de elevar o ponto de ebulição do ácido sulfúrico permitindo a decomposição da matéria orgânica, e um catalisador metálico que aumenta o poder de oxidação do meio.
Posteriormente, adiciona-se hidróxido de sódio concentrado e aquece-se para a liberação da amônia em solução de ácido bórico, formando borato ácido de amônia que constitui forma quantificável do nitrogênio. O borato de amônia formado é titulado com uma solução padronizada de ácido clorídrico.
Em muitos laboratórios estão sendo implementados fundamentos de controle de qualidade para se ampliar a exatidão e a precisão dos resultados produzidos. Para auxiliar nesta meta torna-se importante que os métodos oficialmente aprovados sejam aplicados para
53 que a tecnologia avaliada seja usada nos laboratórios de modo que os resultados produzidos possam ser comparados (Thiex & Manson, 2002).
Desta forma, dada a importância da PB obtida a partir do método de Kjeldahl, faz-se necessária a avaliação dos procedimentos laboratoriais e das estimativas de PB produzidas em diferentes materiais e por diferentes laboratórios, buscando-se identificar variantes mais adequadas e padronizar procedimentos entre laboratórios de análise de alimentos no país.
Objetivou-se conduzir estudo colaborativo para avaliação do teor de PB em diferentes amostras de alimentos em sete diferentes laboratórios de análise de alimentos de instituições integrantes do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Ciência Animal (INCT-CA).
Material e Métodos
As avaliações foram conduzidas em sete laboratórios de análise de alimentos de instituições componentes do INCT-CA: Universidade Federal de Viçosa, Viçosa-MG; Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte-MG; Universidade Federal de Lavras, Lavras-MG; Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus-BA; Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita, Jaboticabal-SP; Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiabá-MT; e Universidade Federal de Mato Grosso, Sinop-MT; entre janeiro e março de 2010.
Foram utilizadas amostras de cana-de-açúcar, silagem de milho, farelo de soja e milho grão. Em adição, foram enviados quatro compostos que foram assumidos como padrões para aferição da exatidão das estimativas: uréia (Sigma U5378), fosfato de amônia monobásico (MAP; Sigma-Aldrich A1645), ácido etileno diamínico tetra-acético (EDTA; Sigma-Aldrich EDS) e sulfato de amônio (Merk 01217).
As amostras de volumosos úmidos foram secas em estufa com ventilação forçada (60ºC) e, em conjunto com as demais amostras, processadas em moinho de facas (1 mm), acondicionadas em sacos plásticos e enviadas sem identificação, juntamente com os padrões, aos laboratórios.
Na oportunidade do envio, solicitou-se a cada laboratório que amostras fossem analisadas por seis dias, consecutivos ou não, sendo realizadas três repetições por amostra por dia de avaliação.
Os resultados foram solicitados com base na amostra seca ao ar, uma vez que a avaliação de resultados com correção para o teor de matéria seca de cada amostra entre laboratórios pode apresentar erro oriundo de dois procedimentos (Mertens, 2003).
54 Em conjunto com as amostras, enviou-se questionário para elucidação dos principais procedimentos e parâmetros analíticos quantitativos e qualitativos adotados em cada laboratório (modelo apresentado no anexo da Tese).
Após o recebimento dos dados, os mesmos foram analisados considerando-se padrões (em termos de recuperação do nitrogênio) e amostras (em termos de teor estimado de PB) separadamente, de acordo com o modelo:
l ijk k ij ij j i ijkl L M LM D Y =µ+ + + + ( ) +ε( ) (1); em que: = constante geral; Li = efeito do laboratório i (aleatório); Mj = efeito do material j
(fixo); LMij = efeito de interação do laboratório i e material j (aleatório); D(ij)k = efeito do dia
de análise k, aninhado à combinação entre o laboratório i e o material j (aleatório); e ε(ijk)l =
erro aleatório, associado a cada mensuração, pressuposto NID (0; ²ε).
Por intermédio do método dos momentos, utilizando-se os fundamentos do procedimento de Hicks modificado (Barbin, 1993), definiram-se as esperanças de quadrados médios da análise de variância, conforme apresentado na Tabela 1.
As observações classificadas como outliers foram eliminadas do conjunto de dados, sendo estas definidas quando seu desvio em relação à média das avaliações do material, dentro do laboratório, superasse em três vezes o valor do desvio padrão residual.
Tabela 1 - Esperança de quadrados médios para modelo destinado à análise global dos dados (padrões e amostras)
Fonte de Variação¹ E(QM)²
L ²ε + k1 × ²D/L×M + k2 × ²L×M + k4 × ²L
M ²ε + k1 × ²D/L×M + k2 × ²L×M + k3 × φM
L × M ²ε + k1 × ²D/L×M + k2 × ²L×M
D/L × M ²ε + k1 × ²D/L×M
Resíduo ²ε
¹ L = laboratório; M = material; L × M = interação laboratório × material, D/L × M = dia aninhado às combinações entre laboratório e material. ² ²ε , ²D/L×M, ²L×M, ²L = variâncias associadas aos efeitos do erro (repetibilidade), de dia aninhado às combinações entre laboratório e material, da interação de laboratório e material e de laboratório, respectivamente; φM = função quadrática associada ao efeito fixo de material.
A partir das esperanças de quadrados médios apresentadas na Tabela 1 estimaram-se a repetibilidade e a reprodutibilidade dos teores de PB, dadas por:
2 ˆε σ = r (2); 2 2 ˆ ˆ L R=σε +σ (3); em que: r = repetibilidade; e R = reprodutibilidade.
55 Quando o efeito de interação de material analisado (amostras) e laboratório foi significativo, procedeu-se a nova avaliação, na qual considerou-se cada material isoladamente.
O modelo para avaliação da variação de cada material considerando-se os diferentes laboratórios é dado por:
k ij j i i ijk L D Y =µ+ + () +ε( ) (4); em que: = constante geral; Li = efeito do laboratório i (aleatório); D(i)j = efeito do dia de
análise j aninhado ao laboratório i (aleatório); e ε(ij)k = erro aleatório, associado a cada
mensuração, pressuposto NID (0; ²ε).
As esperanças de quadrados médios para o modelo descrito em (4) são descritas na Tabela 2. As estimativas de repetibilidade e reprodutibilidade para cada material foram obtidas de forma similar ao descrito nas equações (2) e (3).
Tabela 2 - Esperanças de quadrados médios para o modelo destinado à análise de cada material em função dos diferentes laboratórios (Equação 4)
Fonte de Variação¹ E(QM)²
L ²ε + k1 × ²D/L + k2 × ²L
D/L ²ε + k1 × ²D/L
Resíduo ²ε
¹ L = laboratório; D/L = dia aninhado ao laboratório. ² ²ε , ²D/L, ²L = variâncias associadas aos efeitos do erro (repetibilidade), de dia aninhado ao laboratório e de laboratório, respectivamente.
Para a situação descrita na Tabela 2, procedeu-se à avaliação das estimativas de reprodutibilidade esperada e da razão de Horwitz (Horwitz et al., 1990) por intermédio das equações: X Rp=σˆR (5); R R = σˆ (6);
(
c)
Rpe=2×exp1−0,5×log (7);
Rpe Rp
RH = (8); em que: Rp = reprodutibilidade padronizada em função da média; Rpe = reprodutibilidade padronizada em função da média estimada pelo método de Horwitz; c = concentração média de PB (g/g); e RH = razão de Horwitz.
Em adição, quando o efeito de dia de análise foi significativo, o comportamento de cada material em cada laboratório foi avaliado isoladamente pelo modelo:
56 j i i ij D Y =µ+ +ε() (9); em que: = constante geral; Di = efeito do dia de análise i (aleatório); e ε(i)j = erro aleatório,
associado a cada mensuração, pressuposto NID (0; ²ε).
Por intermédio do método dos momentos (Barbin, 1993), definiram-se as esperanças de quadrados médios associadas ao modelo descrito em (9) (Tabela 3).
Tabela 3 - Esperanças de quadrados médios para o modelo destinado à análise de cada material em cada laboratório em função dias de análise (Equação 9)
Fonte de Variação¹ E(QM)²
D ²ε + k1 × ²D
Resíduo ²ε
¹ D = dia. ² ²ε , ²D = variâncias associadas aos efeitos do erro e de dia de análise, respectivamente.
A variação aleatória total associada ao modelo descrito em (9) foi dada por:
2 2
2 ˆ ˆ
ˆ σ σε
σT = D + (10). Todos os procedimentos estatísticos foram conduzidos por intermédio do programa SAS (Statisical Analysis System, versão 9.2), adotando-se 0,001 como nível crítico de probabilidade para o erro tipo I. As comparações entre médias fornecidas por diferentes laboratórios foram conduzidas utilizando-se o critério de Scheffé. Por outro lado, a avaliação da recuperação de nitrogênio nos diferentes padrões de acordo com os laboratórios foi realizada utilizando-se as propriedades de intervalos de confiança (1- = 0,999).
Resultados e Discussão
Na avaliação dos padrões, as variâncias entre laboratórios e dentro de laboratórios (repetibilidade) representaram aproximadamente 34,5 e 10,3 % da variação total (Tabela 4). Verificou-se que todos os componentes de variância (Equação 1) foram significativos (P<0,001). Isto indica dois entraves nos resultados: a relação entre recuperação e dia de análise e a ocorrência de interação do material analisado com o laboratório no qual a análise é realizada.
A avaliação das recuperações de nitrogênio a partir dos padrões permitiu evidenciar que 25% das observações apresentaram vícios significativos de recuperação (P<0,001). Em todos os casos, os valores indicaram perda de nitrogênio durante o processo analítico (vício negativo) (Tabela 5).
57 Tabela 4 - Estimativas de componentes de variância do modelo global (padrões; Equação 1)
Item Estimativa Valor relativo (%) Valor-P
²L 0,0010 34,5 0,0004 ²L M 0,0005 17,3 <0,0001 ²D/L M 0,0011 37,9 <0,0001 Repetibilidade ( ²ε) 0,0003 10,3 - Variância Total 0,0029 100,0 - Reprodutibilidade 0,0013 - - r/R1 0,2308 - - ¹ Razão repetibilidade/reprodutibilidade.
A avaliação global das amostras propiciou comportamento similar ao observado para os padrões, com variações significativas (P<0,001) em função do dia de análise e a presença de interação (P<0,001) do material com o laboratório. Assim, tanto alimentos como padrões foram analisados diferentemente em cada laboratório e as estimativas dos teores de nitrogênio/PB se mostram dependentes do dia em que a analise foi realizada (Tabela 6). Tabela 5 - Recuperação de nitrogênio (g/g) a partir da composição química teórica dos
padrões pelos diferentes laboratórios
Padrão4
Item Uréia MAP EDTA Sulfato de Amônio Teórico¹ 291,67 76,09 59,93 132,58 MS² 99,76 99,74 99,74 99,69 Esperado³ 290,96 75,89 59,78 132,17 Laboratório 1 0,9840 0,9830 0,9606 0,9554 Laboratório 2 1,0041 1,0030 0,8961* 1,0065 Laboratório 3 0,9565 0,9846 0,9807 0,9758 Laboratório 4 0,9008* 0,9340* 0,9420* 0,9217* Laboratório 5 0,9868 1,0264 1,0103 0,9963 Laboratório 6 1,0424 1,0298 1,0240 1,0461 Laboratório 7 0,9460* 0,9915 0,9670 0,9313* ¹ Percentual estimado a partir do peso atômico e composição molecular. ² Percentual de matéria seca avaliado pelo método de Karl Fischer (Bruttel & Schlink, 2006). ³ Percentual dado pelo produto entre a composição teórica e o teor de matéria seca. 4 Médias seguidas por (*) apresentam vício de recuperação significativo em relação ao teor esperado do padrão utilizando-se as propriedades do intervalo de confiança [(1- ) = 0,999].
De forma geral, assume-se como não aceitável a ocorrência de efeito de interação de material e laboratório (Mertens, 2003). A ocorrência deste indica que os possíveis erros sistemáticos imputados a um dado material em determinado laboratório serão distintos daqueles observados em outro laboratório. A isto se adiciona o fato de que os erros sistemáticos imputados por um laboratório se manifestarão de forma diferenciada em função do material analisado. Isto atribui elemento de confundimento aos cotejamentos dos conteúdos de PB de alimentos e outros materiais, como fezes, sobras e digestas; o que,
58 conseqüentemente, pode comprometer a comparação entre características obtidas em ensaios de consumo, digestão, degradação e metabolismo.
Tabela 6 - Estimativas de componentes de variância do modelo global (amostras; Equação 1) Item Estimativa Valor relativo (%) Valor-P
²L 0,0683 6,2 0,2446 ²L M 0,5288 48,3 <0,0001 ²D/L M 0,2472 22,6 <0,0001 Repetibilidade ( ²ε) 0,2514 22,9 - Variância Total 1,0957 100,0 - Reprodutibilidade 0,3197 - - r/R1 0,7864 - - ¹ Razão repetibilidade/reprodutibilidade.
A interação de material e laboratório é corroborada pela avaliação comparativa das médias obtidas nos diferentes alimentos, na qual se observou variação entre laboratórios, não havendo padrão definido nos perfis de comparações múltiplas. Verificou-se que as diferenças entre laboratórios variaram de 0,50 ponto percentual para o milho a 4,25 pontos percentuais para o farelo de soja (Tabela 7).
Tabela 7 - Comparação entre médias produzidas pelos diferentes laboratórios Material¹ ²
Laboratório Cana SM FS Milho
1 3,67ab 6,75abc 43,68ab 7,55ab 2 3,61ab 7,11ab 44,77ab 7,43ab 3 4,02a 7,06ab 43,45ab 7,71ab
4 3,49b 6,14c 42,62b 7,31b
5 3,71ab 7,53a 45,72ab 7,81a 6 3,42b 6,59bc 46,87a 7,69ab 7 3,63ab 6,73abc 45,87ab 7,75ab
EPM 0,061 0,108 0,449 0,063
ATM3 0,60 1,39 4,25 0,50
¹ SM, silagem de milho; FS, farelo de soja; 2 Médias na coluna, seguidas por letras diferentes, são diferentes pelo teste de Scheffé (P<0,001). 3 ATM, amplitude total entre médias.
A avaliação das amostras individualmente evidenciou variação inter-laboratorial extremamente elevada para o farelo de soja em comparação às demais amostras (Figura 1). Considerando-se que este material possui o maior percentual de PB em comparação aos demais, os vícios de recuperação aqui observados (Tabela 5) causariam desvios mais proeminentes para o farelo de soja, o que parece justificar sua menor reprodutibilidade.
59 0,3197 0,0519 0,2102 3,0800 0,0521 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Geral Cana-de- açúcar Silagem de milho Farelo de soja Milho
Figura 1 - Reprodutibilidade [(%)²] para os diferentes materiais analisados.
Observou-se variação significativa entre laboratórios (P<0,001) para todas as amostras avaliadas (Tabela 8). Adicionalmente, verificou-se que a variação dos resultados entre laboratórios correspondeu de 43,6 a 68,2% da variação aleatória total, ao passo que a repetibilidade (variação intra-labratorial) representou de 11,49 a 42,80% da reprodutibilidade (Tabela 8). O comportamento destes percentuais reitera que diferenças entre laboratórios constituem o fator preponderante das diferenças entre os teores de PB.
Contudo, a avaliação da reprodutibilidade, a qual é dada pela soma da repetibilidade e da variação entre laboratórios apresentou-se em patamares aceitáveis, pois se observou razões de Horwitz (RH) inferiores a 2 para todos os materiais avaliados (Tabela 8). Este parâmetro é dado pela razão entre a reprodutibilidade observada e a reprodutibilidade que deveria ser esperada considerando-se a concentração média do componente analisado (Horwitz et al., 1990).
Adicionalmente, a partir dos dados expressos na Tabela 8, estima-se que as repetibilidades padronizadas (expressas como percentuais das médias) foram de 3,84; 2,31; 2,17; e 1,96% para cana-de-açúcar, silagem de milho, capim-elefante, farelo de soja e milho respectivamente. Estas estimativas indicam os baixos valores relativos da variação entre repetições. Logo, sendo a reprodutibilidade dada pela soma da variação entre repetições e entre laboratórios, os baixos valores de RH (Tabela 8) parecem ter sido causados pela baixa variação entre repetições. Logo, embora aparentemente em patamares adequados, os valores de RH podem não indicar completa adequação das estimativas de reprodutibilidade aqui obtidas.
60 Tabela 8 - Estimativas de componentes de variância do modelo destinado à avaliação
individual dos materiais (Equação 4)
Item Estimativa Valor relativo (%) Valor-P Cana-de-açúcar ²L 0,0322 47,4 <0,0001 ²D/L 0,0160 23,6 <0,0001 Repetibilidade ( ²ε) 0,0197 29,0 - Variância Total 0,0679 100,0 - Reprodutibilidade 0,0519 - - r/R1 0,3796 - - RH 1,5200 - - Média 3,6521 - - Silagem de milho ²L 0,1852 68,2 <0,0001 ²D/L 0,0614 22,6 <0,0001 Repetibilidade ( ²ε) 0,0250 9,2 - Variância Total 0,2716 100 - Reprodutibilidade 0,2102 - - r/R1 0,1189 - - RH 1,8712 - - Média 6,8435 - - Farelo de soja ²L 2,1413 53,9 <0,0001 ²D/L 0,8952 22,5 <0,0001 Repetibilidade ( ²ε) 0,9387 23,6 - Variância Total 3,9752 100,0 - Reprodutibilidade 3,0800 - - r/R1 0,3048 - - RH 1,6478 - - Média 44,7127 - - Milho ²L 0,0298 43,6 <0,0001 ²D/L 0,0163 23,8 <0,0001 Repetibilidade ( ²ε) 0,0223 32,6 - Variância Total 0,0684 100,0 - Reprodutibilidade 0,0521 - - r/R1 0,4280 - - RH 0,8577 - - Média 7,6063 - - ¹ Razão repetibilidade/reprodutibilidade.
Considerando-se as informações constantes na Tabela 8, percebeu-se que para todos os materiais ocorreu efeito significativo do dia de análise (P<0,001) sobre as estimativas de PB. A avaliação isolada deste efeito para cada material analisado em cada laboratório indicou, contudo, que apenas quatro das 28 avaliações apresentaram variações significativas (P<0,001)
61 das estimativas de PB em função do dia no qual a análise foi realizada (Tabela 9), fração que deve ser considerada pequena em comparação às outras avaliações conduzidas neste estudo colaborativo (e.g. ASE; Capítulo 1).
Tabela 9 - Nível descritivo de probabilidade para o erro tipo I associada à variação entre dias de análises para cada material avaliado
Material1
Laboratório Cana SM FS Milho
1 0,0869 0,1062 0,0030 0,0174 2 0,9726 0,5488 0,5439 0,7194 3 0,0227 0,0014 <0,0001 0,0705 4 0,0638 0,0046 0,9494 0,1635 5 0,0041 <0,0001 0,1689 0,0191 6 0,9912 0,0059 0,0954 0,0004 7 0,0298 0,2116 <0,0001 0,3392 ¹ SM, silagem de milho; FS, farelo de soja.
A variabilidade ao longo dos dias de análise implica que os resultados obtidos no processo analítico são diretamente dependentes deste fator, o que, obviamente, pode atribuir efeito de confundimento sobre a composição química do material analisado. Por lógica, evidencia-se que problema atribuído à falta de padronização dos procedimentos intra- laboratoriais soma-se à questão da alta variabilidade inter-laboratorial sobre a confiabilidade dos resultados de PB. A avaliação individual da variação intra-laboratorial (Figura 2), a qual constitui o fator determinante da repetibilidade, indica que, para alguns materiais, a variação entre dias de análise pode representar de 0 (e.g., Figura 3; cana-de-açúcar; Laboratório 2) a 88% (e.g. Figura 3; silagem de milho; laboratório 5) da variação aleatória dos resultados.
Elevada variabilidade foi observada nos métodos praticados pelos diferentes laboratórios (Tabelas 10 e 11), o que evidencia possíveis causas da variação dos resultados (Tabela 8) e do efeito de interação de laboratório e material (Tabelas 4 e 6).
Em nenhuma das características do processo de digestão se verificou homogeneidade entre laboratórios (Tabela 10). As relações entre volume de ácido e amostra, entre mistura digestora e ácido e entre mistura digestora e amostra variaram de 2 a 5 mL/100 mg, de 0,3 a 0,5 g/mL e de 0,6 a 1,25 g/100 mg, respectivamente. Embora nenhum dos valores possa ser considerado extremo, a variabilidade das relações entre laboratórios pode ter contribuído para a variação observada neste estudo.
62 Cana-de-açúcar 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 D E T 1 2 3 4 5 6 7 Silagem de milho 0,0 0,1 0,2 0,3 D E T 1 2 3 4 5 6 7 Farelo de soja 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 D E T 1 2 3 4 5 6 7 Milho 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 D E T 1 2 3 4 5 6 7
Figura 2 - Avaliação das variâncias intra-laboratoriais (D = variância entre dias; E = variância do erro; T = variação aleatória total; T = D + E).
63
Figura 3 - Avaliação fracional da composição da variação aleatória total intra-laboratorial (D = contribuição da variância entre dias; E = contribuição da variância do erro).
Farelo de soja 0,66 0,00 0,86 0,00 0,23 0,32 0,85 0,34 1,00 0,14 1,00 0,77 0,68 0,15 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1 2 3 4 5 6 7 D E Milho 0,53 0,00 0,37 0,23 0,52 0,77 0,08 0,47 1,00 0,63 0,77 0,48 0,23 0,92 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1 2 3 4 5 6 7 D E Silagem de milho 0,31 0,00 0,71 0,63 0,88 0,62 0,19 0,69 1,00 0,29 0,37 0,12 0,38 0,81 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1 2 3 4 5 6 7 D E Cana-de-açúcar 0,34 0,00 0,50 0,65 0,64 0,00 0,47 0,66 1,00 0,50 0,35 0,36 1,00 0,53 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1 2 3 4 5 6 7 D E 63
64 Todos os laboratórios utilizam sulfato de cobre como catalisador metálico, com peculiaridade observada para o laboratório 5, no qual selenito de sódio é utilizado conjuntamente. O uso de selênio como catalisador metálico pode acelerar o processo de digestão; contudo este pode ocasionar perdas de nitrogênio durante a digestão se for utilizado em excesso ou se a temperatura não for rigorosamente controlada, o que torna mais críticas as condições analíticas com a sua utilização (Pomeranz & Meloan, 1978; Cecchi, 2003). Embora o cobre seja considerado catalisador de baixa eficiência em relação, por exemplo, ao mercúrio ou selênio (Cecchi, 2003), sua utilização é recomendada principalmente pelo menor custo e por não requerer etapas analíticas adicionais (como o mercúrio) e não demandar controle rigoroso das condições de digestão (como o selênio).
Nos laboratórios utilizaram-se os sulfatos de sódio ou de potássio como sais para elevação da temperatura de ebulição do ácido sulfúrico. Embora o sulfato de potássio tenha sido inicialmente proposto como sal para essa finalidade (modificação de Gunning de 1889; Pomeranz & Meloan, 1978), admite-se que o sulfato de sódio apresente efeito similar, sendo também recomendado (Silva & Queiroz, 2002).
A relação sal:catalisador na mistura digestora foi relativamente constante entre laboratórios, com exceção do laboratório 3, cuja relação foi extremamente alta. Isto indica baixa concentração do catalisador na mistura digestora, o que pode elevar demasiadamente o tempo de digestão.
As temperaturas de digestão variaram de 350 a 430ºC. Existem diversas recomendações de temperaturas de extração relatadas na literatura, algumas relevando particularidades do processo de digestão. Faithfull (2002) recomendou temperaturas de 310ºC, com tolerância máxima de 320ºC. Contudo, este autor sugeriu somente o uso de selenito de sódio em conjunto com o ácido sulfúrico, cuja temperatura de ebulição passaria a ser de 330ºC. Considerando-se o uso de sal (sulfato de sódio ou potássio), Silva & Queiroz (2002) recomendaram temperatura de digestão de 350ºC. Nestas mesmas condições, Cecchi (2003) sugeriu temperaturas de digestão variando de 370 a 410ºC. Avaliando-se as diferentes recomendações, faixas de temperatura de 350 a 400ºC parecem ser adequadas para o processo de digestão em ácido sulfúrico.
65 Tabela 10 - Características gerais do processo de digestão em função dos diferentes laboratórios
Característica¹
Laboratório MA VA TA RAA SAL CM RSC MMD RMDA RMDAM TD
1 250 5 T 2 Na Cu 10:1 2,5 0,5 1,0 400 2 500 10 T/PA 2 Na Cu 10:1 3 0,3 0,6 430 3 100 5 PA 5 K Cu 62,5:1 2,5 0,5 2,5 350 4 300 10 PA 3,3 Na Cu 10:1 3 0,3 1,0 350 5 200 4 PA 4 Na Cu+Se 10,9:1 1 0,3 1,0 400 6 250 5 PA 2 Na Cu 9:1 1,5 0,3 0,6 400 7 200 5 PA 2,5 K Cu 9:1 2,5 0,5 1,25 400
¹ MA, massa de amostra (mg); VA, volume de ácido sulfúrico (mL); TA, tipo de ácido (T, grau técnico; PA, puro); RAA, relação ácido/amostra (mL/100 mg); SAL, tipo de sal utilizado para elevação da temperatura de ebulição do ácido sulfúrico (Na, sulfato de sódio; K, sulfato de potássio); CM, catalisador metálico utilizado (Cu, sulfato de cobre; Cu+Se, mistura de sulfato de cobre e selenito de sódio na proporção de 15:1); RSC, relação entre o sal e catalisador metálico na mistura digestora (g/g); MMD, massa de mistura digestora (g); RMDA, relação mistura digestora/ácido sulfúrico (g/mL); RMDAM, relação mistura digestora/amostra (g/100 mg); TD, temperatura máxima de digestão (ºC).
66 Neste contexto, a temperatura utilizada pelo laboratório 2 parecer ter sido excessiva. Na presença de excesso de sal, o aquecimento excessivo pode causar perda de nitrogênio na forma de amônia (Cecchi, 2003). Considerando-se que no laboratório 2 empregou-se a maior massa de mistura digestora e a maior temperatura, parece se justificar a baixa recuperação de nitrogênio oriundo do EDTA (Tabela 5). Ressalta-se que entre os padrões aqui utilizados, o EDTA apresenta estrutura orgânica complexa, contendo 10 átomos de carbono por molécula, demandando a ocorrência das reações do processo de digestão de forma mais intensa em comparação aos demais padrões, com estrutura mais simples. Assim, a etapa de digestão parece constituir elemento crítico à análise no laboratório 2.
Variações entre laboratórios também são observadas no processo de destilação (Tabela 11). Com relação à solução de hidróxido de sódio, embora haja variação entre laboratórios, todas as concentrações encontram-se próximas das recomendações observadas na literatura (e.g. 45% p/v, Widham, 1998; 50% p/v, Silva & Queiroz, 2002). O volume de solução de hidróxido de sódio, o volume de solução de ácido bórico e a concentração de ácido bórico variaram de 25 a 50 mL, de 10 a 20 mL e de 2 a 4%, respectivamente.
A avaliação dos procedimentos associados direta ou indiretamente à quantificação de nitrogênio permitiu evidenciar alguns pontos críticos que podem ter contribuído para a