Estudo da interação dos nanomateriais com os fibroblastos por

e citometria de fluxo

As imagens de microscopia de luz invertida de fibroblastos expostos às NFCs ou aos MWCNT-COOHs demonstraram que, no geral, as células apresentaram uma morfologia típica de fibroblastos e cresceram em monocamada aderente. Porém, observou-se que dependendo do NM estudado e quanto maior a concentração deste maior a alteração morfológica celular, tal como pode ser observado nas Figuras 17B-D e 18B-D.

Figura 17. Fotomicrografias de fibroblastos bovinos incubados por 24 horas com diferentes concentrações de NFC. (A) Células cultivadas em meio de cultura celular DMEM (grupo controle); (B) Células expostas a 100 µg ml-1_{; (C) 200 µg ml}-1 _{(D) e 3000 µg}

ml-1 _{de NFC. As setas destacam a formação de agregados. Aumento de 40 X.}

Em ambos os NMs verificou-se a formação de agregados em cultura, principalmente em altas concentrações (Fig. 17 e 18). Já é bem conhecido que os NMs espontaneamente possuem a tendência de formarem agregados ou aglomerados (RODEA-PALOMARES et al., 2011). Isso ocorre, dentre outros fatores, devido às interações de van der Waals que são dominantes em materiais na escala “nano” (ZANGMEISTER et al., 2007; LEE e GECKELER, 2010). O processo de agregação pode torna-se maior quando em contato com os meios de cultura celular. Os componentes dos meios podem aumentar ou diminuir a aglomeração, dependo da ação de Ca2+ ou soro, respectivamente (SOHAEBUDDIN et al., 2010), bem como influenciar a distribuição de tamanho dos agregados. A maioria dos componentes dos meios de cultura favorece a aglomeração, porém Murdock et al. (2008) observaram que a presença de proteinas pode reduzir a atração entre os NMs. Isso ocorre devido à adsorção de proteinas à superfície dos NMs “revestindo-o” e impedindo a interação entre partículas com a mesma composição.

Figura 18. Fotomicrografias de fibroblastos bovinos incubados por 24 horas com diferentes concentrações de MWCNT-COOH. (A) Células cultivadas em meio de cultura celular DMEM (grupo controle); (B) Células expostas a 25 µg ml-1_;

(C) 100 µg ml-1 _{(D) e 400 µg ml}-1 _{de MWCNT-COOH. As setas destacam a}

formação de agregados Aumento de 40 X.

A aglomeração diminui a concentração dos NMs dispersos, enquanto a massa total de NM adicionada ao meio de cultura permanece inalterada, influenciando as respostas biológicas. Wick et al. (2007) e Dhawan, Sharma e Parmar (2009) relataram que os NTCs dispersos foram menos citotóxicos quando comparados àqueles agregados. Estes mesmos autores sugerem que a aglomeração pode alterar as características morfológicas dos NMs. Outro possível efeito consiste na deposição dos agregados de NMs sobre a monocamada celular aderida a placa de cultura acarretando em ação mecânica sobre as células. Estudos anteriores reforçam essa hipótese, uma vez que os efeitos nocivos de MWCNTs na viabilidade celular foram atribuídos à tendência desses NMs formarem agregados (SMART et al., 2006; DAVOREN et al., 2007). Por outro lado, Lima et al. (2012) demonstraram que a agregação de NFCs pode estar relacionada a menores efeitos tóxicos. Assim, a agregação ou aglomeração é um importante fator que deve ser avaliado para melhor entendimento do potencial citotóxico dos NMs (BAVEYER e LABA, 2008).

Para compreender melhor os efeitos da interação das NFCs ou dos MWCNT-COOH e os fibroblastos bovinos cultivados in vitro, foram realizadas análises qualitativas de alterações da morfologia e tamanho celular por citometria de fluxo. As células exposta a baixas concentrações de NFCs ou MWCNT-COOHs (0,2 a 1,0 µg ml-1) não apresentaram alterações nos parâmetros Side Scatter Signal (SSC) e Forward Scatter Signal (FSC) quando comparado ao grupo controle (Fig. 19 e 20). Entretanto, as células cultivadas em contato com altas concentrações de NFCs ou MWCNT-COOHs apresentaram aumento do SSC e diminuição do FSC (Fig. 19 e 20).

A leitura das células pelo citômetro é baseada na dispersão da luz que fornece diversas informações acerca da célula. A medida de dispersão lateral de luz, chamada SSC está relacionada a característica de complexidade interna da célula enquanto a de dispersão frontal de luz chamada FSC está relacionada ao tamanho (CAI et al., 2008). Assim, essas informações são úteis na avaliação do tamanho e forma celular.

Estudos anteriores observaram as mesmas alterações nos parâmetros SSC e FSC em células expostas a diferentes NMs. Cai et al. (2008) observaram que o aumento de SSC foi proporcional a quantidade de NTC complexados às células T de camundongos. Semelhantemente, Sohaebuddin et al. (2010) e observaram um aumento no parâmetro SSC em fibroblastos e macrófagos de camundongos expostos a 100 µg ml-1 MWCNT. Nanopartículas de TiO2 causaram aumento de SSC em células de retina humanas (ZUCKER

et al., 2010). Estes autores atribuíram este aumento a presença de NMs adsorvidos ou endocitados à célula. Particularmente, Suzuki, Toyooka e Ibuki (2007) constataram que elevadas concentrações de nanopartículas de TiO2 (100 a 1000 µg ml-1) causaram maior

aumento no parâmetro de SSC quando comparado a baixas concentrações (10 µg ml-1). Esses resultados foram embasados por achados de microscopia obtidos no mesmo estudo que demonstraram a incorporação citoplasmática dose-dependente de nanopartículas de TiO2

marcadas com sondas fluorescente.

Células monoblastoides humanas expostas a nanopartículas de TiO2 apresentaram

diminuição de FSC e este resultado foi relacionado ao encolhimento celular e alterações citoplasmáticas que são características da fase inicial da apoptose (VAMANU et al., 2008).

A citometria de fluxo é uma tecnologia rápida e precisa que analisa as propriedades ópticas de um grande número de células individualizadas e vem sendo utilizada para monitorar as interações físicas entre os NMs e as células (SUZUKI, TOYOOKA e IBUKI,

2007; CAI et al., 2008; VAMANU et al., 2008; SOHAEBUDDIN et al., 2010; ZUCKER et al., 2010).

Figura 19. Influência de diferentes concentrações de NFCs sobre a morfologia de fibroblastos bovinos após 24 horas de cultura in vitro. Citograma bidimensional em dot plot de SSC (escala logarítima) X FSC (escala linear).

Figura 20. Influência de diferentes concentrações de MWCNT-COOHs sobre a morfologia de fibroblastos bovinos após 24 horas de cultura in vitro. Citograma bidimensional em dot plot de SSC (escala logarítima) X FSC (escala linear).

A avaliação morfológica das células expostas aos NMs é importante, uma vez que o desarranjo celular está associado aos processos de morte por necrose ou apoptose. No presente estudo, as alterações de SSC e FSC foram mais evidentes em fibroblastos expostos a maiores concentrações de NFCs e MWCNT-COOHs quando comparados a menores concentrações ou ao controle (Fig. 19 e 20), possivelmente por maior adsorção desses NMs à membrana plasmática ou seu acúmulo no citoplasma. Esses resultados são coerentes com os encontrados nos ensaios de viabilidade celular que demonstraram citotoxicidade de NFCs e MWCNT-COOH em altas concentrações. A avaliação complementar desses parâmetros citométricos é importante, pois indica alterações da morfologia e tamanho celular decorrentes de efeitos tóxicos dose dependentes dos MWCNT-COOHs e das NFCs em fibroblastos bovinos cultivados in vitro.

5.2 EXPERIMENTO 2 - EMBRIOTOXICIDADE DE NFC E MWCNT-COOH EM