Estudo da interacção entre Freud e Prickle

Inicialmente foram realizados ensaios em que as proteínas-alvo foram adicionadas à coluna, sem a adição prévia de proteína-isco. Estes ensaios permitem verificar se essas proteínas se ligam inespecificamente à matriz da coluna, outro facto que poderá interferir com os resultados finais (Fig. 23).

M 1 2 3 4 5 6

Ao contrário do que ocorreu com Rock e Pias, His6-Freud não aparenta ficar retida na

coluna até à eluição final (Fig. 23).

Este facto pode ser devido a uma quantidade inferior de proteína que é adicionada à coluna, ou ao facto de que esta proteína não estabelece interacções inespecíficas com a matriz da coluna. De qualquer modo, este resultado é promissor, na medida em que não deverá haver interferências para os restantes resultados.

75 kDa

Figura 23 – Ensaio de ligação de His6-Freud à coluna de afinidade usando o anticorpo

anti-His6 para Western Blot.

M – Marcadores moleculares Precision Plus Protein™ Kaleidsocope™ Standards (Bio-

Rad); 1 – Extracto bruto da indução de 4h de His6-Freud; 2 – Flow through da amostra de

His6-Freud; 3 – 1ª lavagem; 4 – 2ª lavagem; 5 – 3ª lavagem; 6 - Eluição final

M 1 2

Na Fig. 24 A e B enco

anti-GST e anti-His6, respect

Nos pistas 1 e 3 obs presentes nos extractos, gar respectivos anticorpos.

O extracto proteico c through (pista 4A) verificam que estamos a saturar a colun e 6A) não se observa qualq

contendo His6-Freud, verific

embora não seja visível a el final (pistas 2A e 2B) verifica

Estes resultados most

Figura 24 – Ensaio de GS

os anticorpos (A) anti-GST M – Marcadores molecula Rad); 1 – Extracto bruto da bruto da indução de 4h de G 3ª lavagem; 7 – Flow throu

25 kDa

50 kDa

2 3 4 5 6 7 8

B encontram-se os resultados do Western Blot utili espectivamente.

3 observamos claramente as proteínas induzidas s, garantindo assim a eficácia do processo de

teico com GST induzido foi depositado na coluna ificamos que nem toda a proteína GST ficou ligad a coluna. Nas fracções correspondentes às lavagen

qualquer libertação de GST da coluna. Após ad verificamos que nem toda a proteína induzida fic el a eliminação do excesso nas lavagens (pistas 8B

erificamos que só está presente a proteína GST (pi

s mostram que His6-Freud não se liga a GST, como

de GST pull-down de GST+His6-Freud com W

GST e (B) anti-His6.

leculares Precision Plus Protein™ Kaleidsocope™

ruto da indução de 4h de His6-Freud; 2 – Eluição

h de GST; 4 – Flow through da amostra de GST; 5 rough da amostra de His6-Freud; 8 – 4ª lavagem;

8 9

utilizandos os anticorpos

uzidas, GST e His6-Freud

o de Western Blot e dos

coluna, e na fracção flow u ligada, garantindo assim vagens do GST (pistas 5A pós adição do 2º extracto da ficou ligada (pista 7B) s 8B e 9B). Na eluição

pista 2A).

como seria de esperar. Western Blot usando

cope™ Standards (Bio- uição final; 3 – Extracto

ST; 5 – 1ª lavagem; 6 – agem; 9 – 6ª lavagem

A B

M 1 2

Na Fig. 25 apresentam

His6-Freud.

O controlo do Wester pelos anticorpos anti-GST e a as adequadas uma vez que c sendo esta proteína também d confirmada a presença de Hi nas lavagens (pistas 8B e 9B que esta proteína não se liga resultados do rastreio do ban se apenas ao fragmento F2 de

Figura 25 – Ensaio de G

usando os anticorpos (A) an M – Marcadores molecula Rad); 1 – Extracto bruto d bruto da indução de 4h de lavagem; 6 – 3ª lavagem; 9 – 6ª lavagem 50 kDa 75 kDa 25 kDa 2 3 4 5 6 7 8

esentamos os resultados do ensaio de GST pull-do

stern Blot corresponde à banda visível nas pista

ST e anti-His6. As quantidades proteicas dos extrac

que confirmamos na eluição final (pista 2A) a p bém detectada no flow through e nas lavagens (pis

de His6-Freud no flow through (pistas 7B), embor

B e 9B). A ausência de His6-Freud na eluição fina

ga ao fragmento F1 de Prickle. Este resultado es o banco de cDNA de ratinho, uma vez que esta pro F2 de Prickle.

de GST pull-down de GST-F1+His6-Freud

(A) anti-GST e (B) anti-His6.

leculares Precision Plus Protein™ Kaleidsocope™ ruto da indução de 4h de GST-F1; 2 – Eluição f

4h de His6-Freud; 4 – Flow through da amostra d

gem; 7 – Flow through da amostra de His6-Freud

8 9

down entre GST-F1 e

pistas 1 e 3, identificadas extractos utilizados foram ) a presença de GST-F1, pistas 4A, 5A e 6A). É embora não seja detectado ão final (pista 2B), mostra tado está de acordo com os sta proteína mostrou ligar-

reud com Western Blot

cope™ Standards (Bio- ição final; 3 – Extracto ostra de GST-F1; 5 – 1ª

Freud; 8 – 4ª lavagem; A

M 1 2

Na Fig. 26 apresentam

His6-Freud.

O controlo do Wester pelos anticorpos anti-GST e a as adequadas uma vez que c sendo esta proteína também d confirmada a presença de Hi 8B e 9B). A ausência de His se liga ao fragmento F2 de Pr de cDNA de ratinho. Nos fragmento F2 de Prickle, algo

Embora Freud perten função que já foi descrita serotonina (Ou et al, 2003; A entre a via de sinalização da P

Figura 26 – Ensaio de G

usando os anticorpos (A) an M – Marcadores molecular Rad); 1 – Extracto bruto da

da indução de 4h de His6-Fr 6 – 3ª lavagem; 7 – Flow lavagem 50 kDa 75 kDa 37 kDa 2 3 4 5 6 7 8

esentamos os resultados do ensaio de GST pull-do

stern Blot corresponde à banda visível nas pista

ST e anti-His6. As quantidades proteicas dos extrac

que confirmamos na eluição final (pista 2A) a p bém detectada no flow through e nas lavagens (pis

de His6-Freud no flow through (pista 7B) mas não

de His6-Freud na eluição final (pista 2B), mostra q

2 de Prickle. Este resultado contradiz os resultados . Nos ensaios de duplo híbrido, esta proteína le, algo que não foi observado com este ensaio de G

pertença a uma família de proteínas das quais ain scrita para esta proteína, como repressor do g 003; Albert et al, 2004), poderia estabelecer mais u ão da PCP e o desenvolvimento neuronal.

de GST pull-down de GST-F2+His6-Freud

(A) anti-GST e (B) anti-His6.

leculares Precision Plus Protein™ Kaleidsocope™ to da indução de 4h de GST-F2; 2 – Eluição final;

Freud; 4 – Flow through da amostra de GST- low through da amostra de His6-Freud; 8 –

8 9

down entre GST-F2 e

pistas 1 e 3, identificadas extractos utilizados foram ) a presença de GST-F2, pistas 4A, 5A e 6A). É as não nas lavagens (pistas ostra que esta proteína não ltados do rastreio do banco teína mostrou ligar-se ao

o de GST pull-down.

ais ainda pouco se sabe, a do gene do receptor de mais um ponto de contacto

com Western Blot

cope™ Standards (Bio- final; 3 – Extracto bruto

-F2; 5 – 1ª lavagem; 4ª lavagem; 9 – 6ª

A

De qualquer modo, devido a não ter sido observada uma interacção in vitro entre esta proteína e Prickle, mesmo tendo em conta o resultado positivo obtido previamente com a técnica de duplo híbrido, implica que o nosso estudo da interacção entre Freud e Prickle foi descontinuado.