Para melhor entender como os híbridos interagem com as ChEs foi realizado um estudo de docking. Devido à significativa variação conformacional observada no sítio de ligação da acetilcolina nas enzimas ChEs, foi utilizada a estratégia de ensemble docking. Esta metodologia consiste na realização do docking molecular em cada estrutura representante com o objetivo de incluir implicitamente a flexibilidade proteica. As estruturas selecionadas foram 1ZGC (Torpedo Californica), 2CKM (Torpedo Californica) e 1Q84 (Mus musculus) para a AChE.107-109 Para a BuChE foi utilizada a estrutura 5K5E (Homo Sapiens).110
Os estudos de ensemble docking foram realizados com o programa de docking molecular GOLD, utilizando a função de avaliação padrão ChemPLP e eficiência do algoritmo genético de 200% - configuração mais indicada para compostos altamente flexíveis. Os isômeros, estados de protonação e tautômeros dos ligantes foram preditos com a ferramenta Babel em pH = 7,5.111
Em um primeiro momento, foi escolhido o inibidor 17c, pois é o composto que apresentou a maior % de inibição da BuChE. O estudo de ensemble docking será realizado com os demais compostos no futuro. Os estudos de docking realizados são preliminares, sendo necessária a determinação dos IC50 para complementar os ensaios
e realizar um paralelo entre a estrutura e a atividade dos híbridos.
O modo de ligação mais favorável do composto 17c com a AChE foi o encontrado na estrutura 2CKM (Figura 30). De acordo com o resultado do docking, o núcleo lofina se encontra no fundo da cavidade enzimática. O núcleo lofina interage com os resíduos de aminoácido aromáticos através de diversas interações do tipo stacking. Dentre as interações observadas, destacam-se as interações - stacking do núcleo imidazol com o Trp84 e as interações das fenilas com a Tyr121 e com a Phe330. A porção benzilamina se encontra no PAS da enzima. A porção clorofenil está comprimida entre os resíduos Trp279 e Tyr70 através de interações stacking. Não foram observadas interações significativas do substituinte cloro nem do grupo amino com a enzima.
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Figura 30: Modo de ligação previsto para o composto 17c com a AChE (2CKM). A) Visão 3D do
inibidor no interior da cavidade enzimática. B) Diagrama 2D mostrando algumas das interações.
O modo de ligação mais favorável previsto do composto 17c com a BuChE está representado na Figura 31. De acordo com os resultados do docking, a lofina se encontra no fundo da cavidade enzimática, interagindo com os resíduos aromáticos através de interações do tipo stacking de forma semelhante ao observado na AChE. Devido a ausência de aminoácidos aromáticos no PAS da BuChE, a porção benzilamina se encontra no bolso acila da BuChE. Nessa região, a porção clorofenil interage com o
46 Trp231 através de interações do tipo T-stacking. Outra interação de destaque é a ligação de hidrogênio que o grupo amina forma com a Pro285 da cadeia principal da enzima. O átomo de cloro também contribui para a atividade interagindo com o oxigênio da carbonila da Ser287, indicando que uma ligação de halogênio é possível.
Figura 31: Modo de ligação previsto para o composto 17c com a BuChE (5K5E). A) Visão 3D do
47 Como citado anteriormente, a principal diferença entre a cavidade enzimática da AChE e da BuChE reside no bolso acila. Os resíduos da AChE Phe288 e Phe290 são substituídos pela Leu286 e Val288 na BuChE, conferindo um maior volume disponível no bolso acila.42 Dessa forma, a BuChE permite que ligantes mais volumosos interajam no bolso acila.49 No caso do híbrido 17c, essa diferença permite que o híbrido interaja com o Trp286 do bolso acila. Na AChE, tal interação não é possível e o híbrido é obrigado a interagir no PAS da enzima. Ainda na AChE, como o híbrido interage no PAS, as outras duas importantes interações que o núcleo benzilamina realiza não são possíveis de ocorrer. Considerando que as interações do núcleo lofina são similares nas duas enzimas, a seletividade do híbrido 17c para a BuChE reside nas interações do núcleo benzilamina.
A ligação de halogênio é uma interação entre enzima e substrato muito importante na química medicinal. Tal interação é dependente da posição e direção da ligação C-X em relação ao grupo da enzima que ira atuar como base de Lewis.112 Olhando para os valores de IC50 determinados até o momento, é possível inferir que o
híbrido 16d possui o grupo Cl com a melhor orientação para realizar a ligação de halogênio com a carbonila da Ser287, apresentando a menor energia de ligação com a enzima. Como já dito anteriormente, esses foram teste preliminares, sendo necessário realizar estudos mais aprofundados dos outros compostos da série para melhor entender a seletividade e a relação estrutura atividade.
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5 CONCLUSÕES
Neste trabalho foram sintetizados os intermediários N-alquilaminolofina através de uma reação tetracomponente “one pot”, além de duas etapas de proteção/desproteção seletiva. Como uma alternativa para a síntese desses intermediários em uma única etapa, realizou-se um estudo da síntese da N- hexanaminolofina utilizando aquecimento por micro ondas. Com esse método, obteve-se a N-hexanaminolofina com 40 % de rendimento. Esse resultado é muito bom, tendo em vista que o rendimento global da síntese em três etapas foi de 38 %. Outras condições reacionais ainda serão testadas, visando o aumento do rendimento da reação.
Sintetizou-se dezoito novos híbridos lofina-benzilamina através da reação de aminação redutiva entre a N-alquilaminolofina e aldeídos aromáticos, utilizando NaBH4
como redutor. Os híbridos foram sintetizados através de uma reação simples com bons rendimentos. Todos os híbridos lofina-benzilamina foram ativos para a inibição da BuChE, apresentando seletividade para essa enzima. Foram calculados IC50 para três
compostos e os valores se encontram na faixa micromolar (0,49-0,92 M) de concentração. Os estudos de modelagem molecular, tanto para a AChE quanto para a BuChE, mostraram que a porção lofina do híbrido se encontra no sítio ativo da enzima. A diferença se encontra na porção benzilamina. Enquanto que na AChE a benzilamina interage no PAS da enzima, na BuChE essa porção interage no bolso acila, localizado no CAS da enzima. Essa diferença deve ser responsável pela seletividade observada em favor da BuChE. Entretanto, estudos mais aprofundados devem ser realizados para corroborar essa hipótese. Em dezembro de 2017, foi depositada a patente referente a esse trabalho registrada no número BR10201702760.
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