Estudo do processo fermentativo

3.8.1. Obtenção dos micro-organismos

A levedura utilizada na pesquisa para produção de xilitol foi a Candida guilliermondii CCT 3544 obtida na Fundação André Tosselo – FAT Coleção de Culturas Tropicais.

3.8.2. Manutenção da levedura e meios de cultivo

3.8.2.1 Meios de reativação e de manutenção das células

Visando à realização do experimento fez-se necessária a utilização dos meios de cultura descritos nas Tabelas 3.3 e 3.4, com a função de reativação e de manutenção das células liofilizadas da C. guilliermondii CCT 3544.

Tabela 3.3. Meio de cultura Sabourad YMA - “Yeast-Malte Extract”(Extrato de Malte- Levedura) para reativação da linhagem Candida guilliermondii CCT 3544

Composição

Extrato de levedura 3,0 g

Extrato de malte 3,0 g

Bacto peptona 5,0 g

Dextrose 10,0 g

Tabela 3.4. Meio de cultura YMA - “Yeast-Malte Extract Agar”(Agar Extrato de Malte-Levedura) para crescimento e manutenção da linhagem Candida guilliermondii CCT 3544 Composição Extrato de levedura 3,0 g Extrato de malte 3,0 g Bacto peptona 5,0 g Dextrose 10,0 g Ágar 20,0 g

Os meios foram esterilizados em autoclave a 1atm de pressão, a 121 °C durante 15 min.

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A Figura 3.5 representa as etapas do procedimento para reativação e multiplicação da levedura Candida guilliermondii CCT 3544.

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Figura 3.5. Fluxograma apresentando as etapas do procedimento para reativação e multiplicação da levedura C. guilliermondii CCT 3544 para utilização nos experimentos fermentativos

3ª etapa

Preparo do inoculo

transferência/asséptica de 1 alçada para tubos de ensaio 5mL/H2O

esterilizada

Tranferência de 1 mL para frascos de erlemneyer 125 mL

50 mL do meio semi-sintético

Recuperação das células por centrifugação Suspensão celular 3g/L ou 107 células/mL Incubação em “Shaker” 200rpm 28 ºC/24h 2ª etapa

Repique em placa de Petri em meio YMA Incubado 28 ºC/ 48h

Armazenamento por refrigeração 2 a 8 °C 1ª etapa Levedura Candida guilliermondii CCT -3544 liofilizada Resuspensão 0,2 mL de H2O (10-15 min) Ativar levedura em 5mL do meio YM

Incubado 28 ºC ≈ 10 dias

3ª etapa

Preparo do inóculo

transferência/asséptica de 1 alçada para tubos de ensaio 5mL/H2O

esterilizada

Tranferência de 1 mL para frascos de erlemneyer 125 mL

50 mL do meio semissintético

Recuperação das células por centrifugação Suspensão celular 3g/L ou 107 células/mL Incubação em “Shaker” 200rpm 28 ºC/24h 2ª etapa

Repique em placa de Petri em meio YMA Incubado 28 ºC/ 48h

Armazenamento por refrigeração 2 a 8 °C

Flávia Cristina dos Santos Lima 52

3.8.2.2. Reativação das células liofilizadas

Para reativação das células foram adicionados 0,2 mL de água destilada com o auxílio de uma pipeta Pasteur, na ampola com a levedura liofilizada, em ambiente estéril; em seguida fez-se uma suspensão das células, deixando-as reidratar por aproximadamente 10-15 min, período após o qual todo o conteúdo foi transferido da ampola para um tubo de ensaio contendo 5,0 mL do meio de cultura líquido indicado na Tabela 3.3 e incubado a 28 ºC.

3.8.2.3. Crescimento das células em meio sólido

A partir da cultura crescida no caldo realizou-se um repique em placa de Petri contendo o meio sólido recomendado na Tabela 3.4 e incubado a 28 ºC por 48 h; após o crescimento as placas de Petri contendo as leveduras foram armazenadas em refrigeração (2 a 8 ºC).

3.8.2.4. Preparo do inóculo

Células de Candida guilliermondii CCT 3544 repicadas em meio de manutenção foram transferidas em condições assépticas, com auxílio de uma alça de platina, para tubos de ensaio contendo cerca de 5 mL de água destilada e esterilizada. Alícotas de 1 mL desta suspensão foram então transferidas para frascos Erlemneyer de 125 mL contendo 50 mL do meio de cultivo semissintético, compostos de:

- 30 g/L de xilose

- 2 g/L de sulfato de amônio - 0,1 g/L de cloreto de cálcio

- 20 g/L de solução de extrato de farelo de arroz

Todas as soluções foram preparadas separadamente; as soluções de xilose e extrato de farelo de arroz foram autoclavadas a 111 ºC, por 15 min; já as soluções estoque de (NH4)2SO4 e de (CaCl2)2H2O a 121 ºC, por 20 min.

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Então, os frascos de erlenmeyer foram incubados em agitador rotatório tipo “shaker”, nas seguintes condições: agitação de 200 rpm, a 28 ºC por 24 h e pH 5,5; após este período as células foram recuperadas ou separadas por centrifugação a 2000 x g (Cu -5000 – Damon/IEC Division), lavadas com água destilada esterilizada, centrifugadas novamente e após descarte do sobrenadante foram utilizadas para preparar uma suspensão celular com cerca de 50 g/L.

3.8.2.5. Preparo da suspensão celular

Após a lavagem com água esterilizada e o processo de centrifugação o sobrenadante foi descartado; em seguida, foram pesados 50 g da massa e diluídos em 1 litro de água; a partir desta suspensão foi calculado o volume necessário para inocular o meio com uma concentração inicial de 3 g/L no meio ou 107 células/mL em todas as fermentações.

3.8.3. Estudo da suplementação e pH no meio pré-hidrolisado de bagaço de pedúnculo de caju

Experimentos para avaliar a influência da adição de nutrientes (sulfato de amônio, cloreto de cálcio, extrato do farelo de arroz) e pH, tal como as prováveis interações, foram estudados utilizando-se do planejamento experimental fatorial 24 com três repetições no ponto central. Os níveis foram definidos a partir de parâmetros utilizados por CANILHA et al. (2006) que avaliaram a influência das concentrações dos nutrientes, fator de concentração do hidrolisado e do pH inicial do meio de fermentação quanto aos parâmetros fermentativos no hidrolisado hemicelulósico da palha de trigo.

Na Tabela 3.5 se encontram os níveis dos fatores utilizados no planejamento em que (-1) e (+1) significam o menor e o maior nível, respectivamente e (0) significa o nível do ponto central; na Tabela 3.6 está apresentado o planejamento fatorial 24com três repetições no ponto central.

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Tabela 3.5. Níveis em valores reais e codificados para os fatores investigados no planejamento fatorial 24com três repetições no ponto central

Variáveis (g/L) Níveis -1 0 +1 Sulfato de amônio (g/L) 1,0 2,0 3,0 Cloreto de cálcio (g/L) 0,5 1,0 2,0 Farelo de arroz (g/L) 5,0 12,5 20,0 pH 4 5 6

Tabela 3.6. Matriz de planejamento fatorial do tipo 24, com 3 repetições no ponto central, para avaliação do efeito da suplementação do hidrolisado com nutrientes na produção de xilitol pela Candida guilliermondii CCT 3544

Ensaios Níveis codificados/reais NH3SO4 (g/L) CaCl2 (g/L) Extrato do farelo de arroz (g/L) pH 1 -1 (1,0) -1 (0,5) -1 (5,0) -1 (4) 2 +1 (3,0) -1 (0,5) -1 (5,0) -1 (4) 3 -1 (1,0) +1 (2,0) -1 (5,0) -1 (4) 4 +1 (3,0) +1 (2,0) -1 (5,0) -1 (4) 5 -1 (1,0) -1 (0,5) +1 (20,0) -1 (4) 6 +1 (3,0) -1 (0,5) +1 (20,0) -1 (4) 7 -1 (1,0) +1 (2,0) +1 (20,0) -1 (4) 8 +1 (3,0) +1 (2,0) +1 (20,0) -1 (4) 9 -1 (1,0) -1 (0,5) -1 (5,0) +1 (6) 10 +1 (3,0) -1 (0,5) -1 (5,0) +1 (6) 11 -1 (1,0) +1 (2,0) -1 (5,0) +1 (6) 12 +1(3,0) +1 (2,0) -1 (5,0) +1 (6) 13 -1 (1,0) -1 (0,5) +1 (20,0) +1 (6) 14 +1 (3,0) -1 (0,5) +1 (20,0) +1 (6) 15 -1 (1,0) +1 (2,0) +1 (20,0) +1 (6) 16 +1 (3,0) +1 (2,0) +1 (20,0) +1 (6) 17 0 (2,0) 0 (1,0) 0 (12,5) 0 (5) 18 0 (2,0) 0 (1,0) 0 (12,5) 0 (5) 19 0 (2,0) 0 (1,0) 0 (12,5) 0 (5)

Flávia Cristina dos Santos Lima 55

Os ensaios fermentativos foram conduzidos em frascos Erlenmeyer de 125 mL contendo 50 mL do meio de fermentação, 3 g/L de inóculo e suplementado de acordo com o delineamento experimental apresentado nas Tabelas 3.5 e 3.6. Os frascos foram mantidos em incubadora de movimento rotatório sob agitação de 200 rpm e temperatura de 28 ºC, pelo tempo de 0 a 96 h a fim de identificar os fatores que influenciam os parâmetros fermentativos consumo de xilose (Y), produtividade volumétrica em xilitol (QP), fator de conversão de xilose em xilitol Y(P/S) e eficiência de conversão (η); as

análises dos dados foram realizadas com auxílio do programa Statistica versão 5.0. 3.9. Processo fermentativo da ampliação de escala (3 vezes)

Após a determinação da melhor condição experimental a produção de xilitol foi ampliada para frascos de Erlenmeyer com capacidade de 250 mL contendo 150 mL do meio in natura, concentrado e concentrado/tratado (remoção com lignina residual definida no item 3.7), em um agitador de movimento rotatório (SHAKE – Tecnal TE- 420) a 200 rpm e temperatura de 28ºC; a concentração inicial do inóculo foi de 107 células/mL para todos os ensaios; amostras foram retiradas em intervalos de tempo (0, 12, 24, 36 e 48 h) e submetidas à análise de xilitol.