ESTUDO DO TRANSCRIPTOMA DE Pseudomonas aeruginosa PAO1 NA

4.4.1. Estudos fermentativos iniciais para seleção de condições de cultivo para os estudos de microarranjos

4.4.1.1 Preparo do inóculo

O pré-inóculo foi realizado em frascos Erlenmeyers de 125 mL contendo 50 mL do meio PTYG, inoculados com 1 ou 2 colônias bacterianas isoladas a partir de placas de petri [PTYG + ágar 1,5 % (m/v)] e incubados, em agitador orbital, a 37°C por 5-7 h sob agitação de 200 rpm. O crescimen to bacteriano durante o preparo do inóculo foi acompanhado pela determinação da absorbância do meio de cultivo a 600 nm (4.5.1), e o cultivo utilizado como inóculo quando a D.O.600

encontrava-se entre 0,6 e 0,8.

4.4.1.2. Curva de crescimento de Pseudomonas aeruginosa PAO1

Os experimentos de curva de crescimento foram conduzidos em frascos Erlenmeyers de 250 mL contendo 100 mL de meio de sais (contendo por litro: 3,0 g KH2PO4; 7,0 g K2HPO4; 0,2 g MgSO4.7H2O e 1,0 g (NH4)2SO4) acrescentados de 4

% (m/v) de glicerol, ou uma das combinações a seguir: 3 % (m/v) glicerol + 1 % (m/v) caseinato de sódio, 3 % (m/v) glicerol + 1 % (m/v) caseína hidrolisada ou 3 % (m/v) glicerol + 1 % (m/v) casaminoacidos. Os meios foram esterilizados por 15 min, a 121ºC, resfriados e inoculados em uma proporção de 1 % de volume de inóculo (item 4.4.1.1) em volume de meio, e incubados, em agitador orbital, a 37°C sob agitação de 200 rpm. O crescimento bacteriano foi acompanhado pela determinação da absorbância do meio de cultivo a 600 nm (4.5.1) de alíquotas de 1,0 mL. Nos

experimentos que utilizaram como fonte de carbono glicerol ou glicerol + caseinato de sódio, as curvas de crescimento, também foram feitas por plaqueamento e contagem de unidades formadoras de colônias. Os ensaios foram feitos em triplicata.

4.4.1.3. Produção de ramnolipídeos por Pseudomonas aeruginosa PAO1

Os cultivos foram realizados em frascos Erlenmeyers 250 mL, contendo 100 mL de meio de sais (item 4.4.1.2) adicionados de fonte de carbono ou misturas de fontes de carbono (glicerol; caseinato de sódio; óleo de soja; glicerol + caseinato de soja; glicerol + caseína hidrolisada; glicerol + casaminoácidos; glicerol + óleo de soja; e glicerol + óleo de soja + caseinato de sódio). Os meios foram esterilizados por 15 min, a 121 ºC, resfriados e inoculados em uma proporção de 1 % volume de inóculo (item 4.4.1.1) em volume de meio. Os cultivos foram interrompidos, no tempo de fermentação oportuno, centrifugados a 12.500×g a 25 °C por 10 min, e o sobrenadante obtido submetido à quantificação indireta dos ramnolipídeos pelo método de fenol-sulfúrico (item 4.5.5).

4.4.2. Coletas de amostras para obtenção de RNA

Amostras dos cultivos de PAO1 foram coletadas em diferentes fases de crescimento do microrganismo (entre 4,5 h e 48 h de cultivo). Às alíquotas coletadas adicionou-se, imediatamente, reagente protetor de RNA [RNA-protector® (Qiagen)]

na proporção de 2:1 (reagente:amostra) e a mistura resultante foi armazenada a -80 °C. Adicionalmente, foram coletas amostras para a determinação da concentração celular por contagem de unidades formadoras de colônia.

4.4.3. Etapa de lise celular

As amostras (item 4.4.2) foram descongeladas em bloco aquecido a 37 °C e centrifugadas a 5000×g por 5 min. O equivalente a 1 × 10⁹ células de P. aeruginosa foi re-suspendido em 100 µL de tampão TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) contendo 400 µg/mL de lisozima. As reações foram incubadas por 5 min em temperatura ambiente e homogeneizadas, com o auxílio de um vortex, por 10 s a cada 2 min.

4.4.4. Extração do RNA

O RNA bacteriano total foi extraído através de eluição em mini-colunas do kit RNeasy® Mini (Qiagen). Para isto, foram adicionados 350 µL de tampão RLT (do kit) adicionado de β-mercaptoetanol (10 µL β-ME /mL de RLT) aos 100 µL resultantes da reação de lise celular (item 4.4.3). Para precipitar o RNA, foram adicionados 250 µL de etanol anidro gelado. A amostra (700 µL) foi prontamente transferida para uma mini-coluna previamente posicionada sobre um tubo de coleta (do kit). O sistema foi centrifugado a 9000×g por 15 s, e o eluato foi descartado. Foram adicionados à mini-coluna 500 µL de tampão RPE [(do kit) para lavar a membrana da mini-coluna]. O sistema foi centrifugado a 9000×g por 15 s, e o eluato foi descartado. Este passo de adição de tampão RPE e centrifugação (2 min) foi repetido. A mini-coluna foi posicionada sobre um microtubo de 1,5 mL, foram adicionados 30-60 µL de DEPC-H2O livre de RNase ao centro da membrana da mini-coluna, e o sistema foi centrifugado a 9000×g por 1 min, para eluir o RNA.

4.4.4. Tratamento do RNA total com DNase

O RNA total purificado foi tratado com DNaseI, segundo protocolo do fabricante com pequenas alterações (Qiagen off-column DNase treatment). A 15 µL de RNA, foram adicionados 2 µL de tampão de DNaseI [Tris-HCl (500 mM), MgCl2.6H2O (50 mM), Ditiotreitol (10 mM)], 2,5 µL de inibidor de RNase [(10 U) Invitrogen] e 1 µL de DNase livre de RNase [(1U) Invitrogen]. As reações foram incubadas a 37 °C por 30 min e interrompidas com a adição de 2 µL de EDTA (140 mM, pH 8,0 em DPEC-H20) seguido de incubação por 5 min a 65 °C. O RNA to tal contido na solução resultante foi quantificado por Fluorometria (item 4.5.10) e sua qualidade, assim como a ausência de DNA, foi checada em eletroforese em gel de agarose (item 4.5.11). Adicionalmente, a contaminação do RNA com DNA genômico foi checada por reação de PCR, utilizando-se oligonucleotídeos iniciadores para o gene rhlB (ramnosiltranferase 1) e subseqüente eletroforese em gel de agarose (item 4.5.11).

4.4.5. Concentração do RNA total

As amostras de RNA, já livres de DNA genômico (item 4.4.4), foram concentradas por precipitação do RNA com etanol. Aos microtubos de 1,5 mL, contendo 200 µL RNA, foram adicionados 50 µL de NH4OAc (10 M) e 500 µL de etanol anidro gelado. A mistura foi acondicionada a -20 °C por 2 h e centrifugada a 8750 × g por 10 min a 4 °C. O sobrenadante foi removido e 5 00 µL de etanol 70 % foram adicionados. A mistura resultante foi centrifugada a 8750 × g por 5 min a 4 °C e o sobrenadante removido cuidadosamente através do uso de uma micropipeta.

Para a evaporação do etanol 70 % residual, o microtubo contendo o pellet de RNA foi acondicionado, aberto, em banho de gelo dentro da câmera de fluxo laminar por um período de 90 a 120 min. Os pellets de RNA foram então armazenados a - 80 °C e submetidos ao Genomics Shared Service (Arizona Cancer Center, University of

Arizona, Tucson-AZ) onde os processamentos do GeneChip P. aeruginosa genome array foram feitos.

4.4.6. Processamento do GeneChip genome array

As etapas de síntese de cDNA, fragmentação, marcação da sonda e hibridização foram feitas segundo os protocolos do fabricante (Affymetrix) no Genomics Shared Service (Arizona Cancer Center, University of Arizona, Tucson-AZ). Adicionalmente, outra etapa de avaliação da quantidade e qualidade do RNA foi feita no Genomics Shared Service antes do processamento do GeneChip genome array. O RNA foi quantificado e qualificado, respectivamente, medindo-se sua absorbância a 230, 260 e 280 nm, em um espectrofotômetro ND-1000 (NanoDrop Technologies) e analisado por eletroforese capilar, utilizando o sistema Bioanalyzer (Agilent Technologies).