Estudo dos microrganismos ruminais

Os ruminantes, como bovinos, ovinos, búfalos e cabras são de grande importância para a produção de carne, leite, lã e couro. Têm um sistema digestivo complexo, onde a digestão dos alimentos tem início no rúmen, que contem grande número de bactérias, protozoários e fungos (VAN SOEST, 1994).

Estes diferentes microrganismos formam uma comunidade complexa que interagem uns com outros e desempenham um papel muito importante na digestão dos alimentos e o fornecimento de nutrientes para o hospedeiro na forma de ácidos graxos voláteis e de proteína microbiana (MIRON; BEN-GHEDALIA; MORRISON, 2001).

Segundo a classificação de Woese (WOESE; KANDLER; WHEELIS, 1990), os microrganismos presentes no ecossistema ruminal podem ser classificados em três domínios: Bactérias (bactérias), Archaea (methanogênicos) e Eucarya (protozoários e fungos). As bactérias constituem a maior proporção da biomassa microbiana ruminal (60 a 90%) e são as mais ativas fermentadoras, mais estudadas e consideradas as mais importantes nutricionalmente (PETRI et al., 2012).

Historicamente, a maior parte dos conhecimentos da composição microbiana do rúmen surgiram pelo uso de métodos tradicionais como a técnica “roll tube”

(HUNGATE, 1969) ou pela técnica do número mais provável (DEHORITY;

TIRABASSO; GRIFO, 1989). No entanto, o uso de culturas para conhecimento dos microrganismos ruminais representam apenas uma pequena fração de comunidades microbianas naturais e, portanto, a diversidade microbiana é grosseiramente subestimada (WINTZINGERODE; GOBEL; STACKEBRANDT, 1997), em valores que oscilam entre 5% e 50% das populações totais (KRAUSE et al., 2003), isto provavelmente compreende mais de 1000 espécies individuais de microrganismos (DENG et al., 2008).

Recentemente, há um interesse crescente na enumeração rápida e precisa de populações microbianas, especialmente utilizando modernos métodos moleculares.

Devido à conservação evolutiva do gene 16S / 18S ribossomal RNA (rRNA) e seus genes que codificam (rDNA) (PACE; OLSEN; WOESE, 1986), técnicas moleculares baseadas em 16S/18S rRNA/rDNA podem ser usadas para proporcionar a enumeração dos microrganismos, a caracterização molecular, assim como sistema de classificação, que prediz relações evolutivas, sem a necessidade de cultiva-los.

As técnicas moleculares superam as limitações dos meios de cultivo e fornecem ferramentas para entender o funcionamento de comunidades microbianas ruminais, tais como estrutura, diversidade, dinâmica das populações, degradação e transformação dos componentes dietéticos (DENG et al., 2008) e tornaram-se

ferramentas essenciais para determinar as mudanças que ocorrem dentro das comunidades microbianas, por exemplo, durante as mudanças na dieta (HENDERSON et al., 2013).

A reação em cadeia de polimerase em tempo real (qPCR) é uma ferramenta útil que permite a rápida quantificação de uma sequência de DNA alvo através do desenho de sequencias iniciadoras específicas (primers) (DENMAN; McSWEENEY, 2006). Recentes estudos em nutrição de ruminantes têm utilizado a técnica de qPCR para a quantificação relativa de bactérias celulolíticas de interesse como Ruminococcus e Fibrobacteres assim como o monitoramento das populações das Archaeas em função das mudanças na dieta (RIBEIRO et al., 2015; GRANJA-SALCEDO et al., 2016; RIBEIRO et al., 2016; SAN VITO et al., 2016). No entanto, uma das limitações desta técnica é a necessidade de ter primers específicos para cada microrganismo a ser identificado e quantificado, impossibilitando avaliar o efeito geral da dieta sobre a população microbiana total.

Já o sequenciamento de uma fração do 16S rRNA é considerado uma das ferramentas mais importantes do estudo dos sistemas biológicos (DENG et al., 2008).

Em procariotos a diversidade microbiana é frequentemente estudada por meio do uso de amplicons baseados na sequência da pequena subunidade do gene que codifica o rRNA 16S. Esses genes estão presentes em todos os organismos, consistem em regiões conservadas e regiões variáveis permitindo a diferenciação entre populações microbianas (WOESE, 1987).

Em bactérias o gene 16S rRNA é constituído por sequências conservadas intercaladas com sequências variáveis que incluem 9 regiões hipervariáveis (V1-V9), o comprimento destas regiões hipervariáveis variam de cerca de 50 bases a 100 bases (PETROSINO et al., 2009). O grande número de sequências do 16S rRNA, atualmente disponíveis em bancos de dados públicos, permite o uso deste gene como marcador filogenético, sendo assim possível obter a classificação das unidades taxonômicas operacionais (OTU) em diferentes níveis (reino, filo, classe, ordem, família, gênero e espécie). A comunidade microbiana ruminal é caracterizada por alta diversidade em baixos níveis taxonômicos (gênero e espécie) e baixa diversidade no nível do filo (McSWEENEY et al., 2007).

A comparação das sequências do 16S rRNA tem reportado um alto grau de diversidade bacteriana ruminal, assim como novas espécies continuam sendo identificadas e descritas (QI; JAKOBER; McALLISTER, 2010). Em bovinos, Firmicutes e Bacteroidetes são os dois filos dominantes no rúmen (WU et al., 2012; KOIKE et al., 2003; OZUTSUMI et al., 2005), estes grupos possuem grande atividade proteolítica e celulolítica realizando funções essenciais na conversão de energia (CHEN et al., 2015).

Existem diversas fontes de variação em estudos onde o objetivo é explorar a população microbiana do rúmen e os fatores que afetam a estrutura dessa população são muito complexos, incluindo as alterações na espécie, dieta, idade, posição geográfica e saúde do animal hospedeiro (LI et al., 2009; SARO; RANILLA; CARRO, 2012; HENDERSON et al., 2013; HENDERSON et al., 2015). Um DNA metagenômico de rendimento e qualidade suficiente é o material de partida fundamental para as análises moleculares (HENDERSON et al., 2013).

A adequada amostragem ruminal, conservação da amostra assim como o método de extração do DNA metagenômico, são os principais fatores que influenciam o rendimento do DNA obtido. Altos rendimentos de DNA refletem uma melhor representação do DNA da comunidade estudada (McSWEENEY et al., 2007).

Adicionalmente, é importante avaliar a integridade e pureza do mesmo, já que para análises moleculares como qPCR e sequenciamento do gene 16S rRNA, se recomenda um DNA integro e uma pureza do DNA metagenômico dentro da faixa de absorbância A260 / A280 de 1.8 - 2.0 (TATAUROV; YOU; OWCZARZY, 2008).

Os habitantes da comunidade microbiana do rúmen são muito diversos e nem todos os métodos de extração de DNA funcionam igualmente para os diferentes grupos microbianos (HENDERSON et al., 2013). Vários estudos têm mostrado que o método de extração de DNA utilizado pode influenciar a representação da comunidade microbiana em amostras a partir de diferentes habitats (KRSEK; WELLINGTON, 1999;

ARIEFDJOHAN; SAVAIANO e NAKATSU, 2010; HENDERSON et al., 2013), incluindo o rúmen (YU e MORRISON, 2004; HENDERSON et al., 2013; VILLEGAS-RIVERA et al., 2013). Outros estudos têm indicado que a técnica de amostragem do conteúdo ruminal (sonda oral ou coleta através de cânula ruminal), o fracionamento da amostra do rúmen (líquida e sólida) (GEISHAUSER; GITZEL, 1996; PITTA et al., 2010; FOUTS

et al., 2012; HENDERSON et al., 2013), assim como o horário de coleta da amostra ruminal (SARO; RANILLA; CARRO, 2012) também pode modificar os parâmetros da comunidade microbiana estudada.

Devido ao tempo requerido para realizar as coletas ruminais em experimentos de metabolismo, onde geralmente vários períodos experimentais são requeridos, além dos equipamentos e matérias ou kits específicos necessários para a extração do DNA metagenômico, surge a necessidade de armazenar as amostras ruminais para as análises microbiológicas. Este armazenamento dependo das condições experimentais e dos recursos dos pesquisadores, pode variar de meses a anos. Atualmente, não existe uma padronização do método de armazenamento das amostras ruminais antes da extração do DNA e são vários os métodos que em diversos estudos são mencionados, entre estes métodos os mais comuns são: Congelamento e liofilização da amostra do conteúdo ruminal após a coleta (HENDERSON et al., 2013; PETRI et al., 2015), ii) Congelamento e armazenado a -80ºC (SHINGFIELD et al., 2012; ZHOU et al., 2012; VILLEGAS-RIVERA et al., 2013; PETRI et al., 2013) ou a -20ºC (FERNANDO et al., 2012; PATRA; YU, 2012; ZHANG et al., 2014), e iii) processamento com soluções tampão fosfato para a separação das bactérias aderidas a fibra e centrifugação para a obtenção de um pelet bacteriano a ser utilizado na extração do DNA (PATEL et al., 2014; RIBEIRO et al., 2015; GRANJA-SALCEDO et al., 2016; RIBEIRO et al., 2016; SAN VITO et al., 2016).

A liofilização do conteúdo sem processamento se baseia na remoção da água intracelular do material congelado, por sublimação, evitando a formação de cristais de gelo, capazes de provocar danos às estruturas celulares, além da degradação de enzimas presentes no citosol (COSTA; FERREIRA, 1991; MORGAN et al., 2006).

Enquanto o armazenamento por congelamento a -20°C ou a -80°C é um dos métodos de manutenção mais simples e baratos, se baseia na redução significativa no metabolismo celular (COSTA; FERREIRA, 1991; TORTORA; FUNKE; CASE, 2012).

Porém, verifica-se danos causados às células em decorrência da formação de cristais de gelo (ROMEIRO, 2006). Estes métodos utilizados poderiam conservar os microrganismos por um tempo, no entanto, ainda não se conhece quanto tempo poderiam ser conservados em amostras ruminais, e se o tipo ou o tempo de armazenamento pode influenciar o resultado final das análises moleculares a serem

realizadas nas amostras. Há escassez de trabalhos que avaliem quais metodologias são mais eficientes com relação à tipo e tempo de armazenamento do conteúdo ruminal com a finalidade de estudos microbiológicos utilizando ferramentas moleculares.

O estudo da microbiota ruminal deve ser visto como uma importante área de pesquisa estratégica, logo que o conhecimento detalhado da microbiota ruminal e dos parâmetros que a afetam está diretamente ligado ao potencial de desenvolvimento da produtividade da pecuária tropical. O uso da biologia molecular na identificação e quantificação dos microrganismos do rúmen é uma ferramenta inovadora e eficiente, caracterizando de forma precisa e rápida o perfil da microbiota ruminal presente e permitindo identificar relações entre as populações microbianas, as respostas metabólicas e produtivas no animal em decorrência da manipulação dietética.