Estudo dos possíveis produtos de degradação formados

A determinação e a possível quantificação dos produtos da degradação (PD) anaeróbia de SMX e CIP foi realizada em conjunto com o Laboratório de Cromatografia (CROMA) do Departamento de Química e Física Molecular do Instituto de Química de São Carlos (IQSC/USP), sob orientação do Professor Álvaro José dos Santos Neto. O grupo de pesquisa tem conduzido estudos sobre detecção e quantificação de produtos intermediários na degradação biológica e físico-química de antibióticos.

Como um teste preliminar foram conduzidos ensaios em batelada para avaliação dos

produtos intermediários da degradação anaeróbia de SMX e CIP em alta concentração (5 mg L-1_{), a fim de facilitar sua detecção. Para esse ensaio foi utilizado biomassa imobilizada}

em espuma de poliuretano adaptada em reator anaeróbio sem aplicação de antibiótico no substrato de alimentação (descrito na seção 4.4).

Ao atingir condições estáveis de operação, as espumas com biomassa imobilizada foram retiradas do reator e transferidas para frascos do tipo Duran de 500 mL. Adicionou-se em cada frasco solução contendo esgoto lab-made - Torres (1992) adaptado (seção 4.4) - com os antibióticos na concentração de 5 mg L-1_{, totalizando um volume reacional de 400 mL. Um} frasco com biomassa inativada (NaN3 20 g L-1 por 24 h) foi utilizado para cada antibiótico a fim de avaliar a sorção dos fármacos na biomassa. Também foi preparado um frasco controle sem antibiótico e um controle abiótico sem a biomassa para cada fármaco. Para que o substrato ficasse totalmente anaeróbio foi aplicado um fluxo de gás nitrogênio em cada frasco durante 20 minutos. Então, os frascos foram tampados e colocados sob agitação ao abrigo da luz em shaker a 125 rpm e 30 °C.

Para o sulfametoxazol foi avaliado os produtos de degradação após 72 h, enquanto para a ciprofloxacina, as amostras foram retiradas após, 24, 48 e 72 h, de forma a identificar possíveis compostos intermediários. As amostras ao final de cada ensaio foram centrifugadas para separação da fase líquida e sólida, e o sobrenadante filtrado em membrana de 0,22 µm. A biomassa aderida na espuma foi retirada por meio de lavagem com água destilada e agitação com pérolas de vidro em tubo tipo falcon. Parte da biomassa foi utilizada para a análise do teor de sólidos e parte foi armazenada em freezer para posterior extração com solventes (MeOH e ACN) e análise de sorção dos antibióticos, conforme descrito na seção 4.9.

A fase líquida das amostras foi pré-concentrada 400 vezes por meio de SPE manual em cartuchos HLB de 3 mL (Waters Oasis), que foram acondicionados com 3 mL de MeOH seguido de 3 mL de água ultrapura a pH 3 (ajustado com ácido fórmico 98 % v/v). Após o

carregamento da amostra, a eluição sequencial foi realizada utilizando 1 mL de MeOH, seguido de 1 mL de ACN basificada (NH4OH a 5 % v/v), 1 mL de ACN pura, e 1 mL de ACN acidificada (ácido fórmico a 5 % v/v). O extrato resultante foi seco sob uma corrente de gás nitrogênio em evaporador automático (XCelVap Biotage) e depois reconstituído com 1 mL de uma solução de água ultrapura com 5 % (v/v) de ACN.

As amostras concentradas foram analisadas em um sistema LC-ESI-QqToF/MS compreendido por um HPLC Shimadzu série 20A Prominence e espectrômetro de massas Bruker Daltonics modelo micrOTOF-Q II, equipado com coluna Kinetex XB-C18 (100 mm x 2,1 mm; 2,6 μm) da Phenomenex. Como fase móvel utilizou-se água ultrapura com 0,1 % ácido fórmico (A) / acetonitrila com 0,1 % ácido fórmico (B) utilizando a seguinte programação de gradiente: 0-3 min, 5 % de B; 3-12 min, 5-60 % de B; 12-14 min, 60-95 % de B; 14-20 min, 95

% de B; 20-22 min, 95-5 % de B; 22-26 min, 5 % de B. A vazão utilizada foi de 0,25 mL min-1 _{e temperatura do forno foi de 40°C. A interface de acoplamento do cromatógrafo com}

o espectrômetro foi por electrospray em modo positivo. Os parâmetros utilizados para esse método foram: voltagem do capilar de 4,5 kV, temperatura de dessolvatação de 200 °C, vazão do gás de secagem a 8 L min-1 _{e pressão do nebulizador 4 bar, intervalo de massas (m/z)} monitorado de 50 a 3000 Da, taxa de aquisição de espectros de 2 Hz no modo full MS.

Como tentativa de identificação dos produtos formados, foram realizados experimentos de MS/MS dos compostos encontrados em um analisador de massas híbrido, de resolução unitária e alta sensibilidade (espectrômetro de massas ABSciex QTRAP® _{5500). O sistema LC-} ESI-QTRAP/MS, constituído por um HPLC Agilent Technologies 1260 Infinity, com uma coluna Poroshell 120 EC-C18 (50 mm x 3.0 mm; 2.7 μm) foi operado nas mesmas condições cromatográficas do sistema QqToF. A fonte de íons foi operada no modo electrospray positivo, segundo os seguintes parâmetros: voltagem do capilar de 5,5 kV; temperatura de 650 °C, gás de colisão em médio; cortina de gás de 20 psi, gás de aquecimento (GS1) de 50 psi e gás de nebulização (GS2) de 50 psi. As análises foram realizadas no modo EPI (enhanced product ion) e modo SRM (selected reaction monitoring) com dwell time de 10 ms, declustering potential de 56 V, entrance potential de 10 V, colision energy de 25 V e exit potential de 10 V para todas as transições monitoradas. Na Figura 31 é apresentado um resumo do procedimento experimental adotado para a análise e identificação dos produtos de degradação de SMX e CIP nos reatores em batelada.

Figura 31 - Esquema do procedimento adotado para a identificação dos produtos de degradação de SMX e CIP no ensaio em batelada

Fonte: Autoria própria.

Para a identificação dos possíveis PDs formados a partir de SMX e CIP nos ensaios de degradação em batelada, foram comparados os espectros de massa resultantes das amostras com biomassa ativa com os sem biomassa. As amostras sem adição dos fármacos serviram como linha de base dos espectros de massa da matriz aquosa, de forma a descartar os compostos característicos da matriz. Com o auxílio do software Data Analysis (Bruker) foi possível comparar os cromatogramas de íon total das amostras degradadas com as amostras controle. Analisando os picos cromatográficos e os espectros de massas das amostras degradadas nas quais os picos não apareceram no controle nem na matriz, pôde-se determinar as massas dos possíveis PDs e estabelecer o padrão de fragmentação pelos espectros de MS/MS. Finalmente, com base no padrão de fragmentação dessas massas selecionadas foi possível propor estruturas moleculares para os compostos.

A partir dos espectros de massas e com as transições resultantes para os possíveis PDs foi possível monitorá-los nos reatores RALFE e RALFO, considerando as concentrações reais de operação. Para isso, os fragmentos que apresentaram maior intensidade de sinal analítico foram então selecionados para o desenvolvimento de um método SRM (selected reaction monitoring)

para o estudo das amostras do perfil espacial dos reatores. Para garantir um alto fator de concentração dos PDs, foi coletado um volume de aproximadamente 400 mL para cada ponto de amostragem lateral do reator. As amostras coletadas foram filtradas em membrana de 0,45 µm para então passar pelo procedimento de extração por SPE manual (conforme descrito anteriormente) e detecção dos PDs por LC-MS/MS. Neste caso foi empregado o espectrômetro de massas ABSciex QTRAP 5500 (ABSciex, Canadá), descrito na seção 4.5.1, uma vez que esse possui maior sensibilidade, podendo detectar massas de analitos em concentrações muito baixas.