Estudo Eletrofisiológico

2.5.1. Preparação Biventer Cervicis de Pintainho: O músculo biventer cervicis ou digástrico cervical de pintainho contém fibras fásicas focalmente inervadas e fibras tônicas com inervação múltiplas. Deste modo pode ser estimulada por agonistas colinoniméticos exogenamente aplicados, bem como por estimulação direta no nervo motor. Isto permite distinguir efeito pré-sináptico e pós-sináptico.

A preparação foi isolada e montada de acordo com o método descrito por GINSBORG & WARRINER (1960). O músculo foi suspenso em 5 ml de solução de Krebs pH 7,4 e mantido à temperatura de 37°C, arejado com carbogênio (mistura 95% O2 e 5% CO2).

O músculo foi submetido a uma tensão constante de 0,5 g e estimulado através de eletrodos bipolares posicionados na região entre o tendão e o músculo de modo a realizar uma estimulação de campo. Estimulador GRASS S4 foi usado para submeter a preparação a estímulos indiretos supramaximais (4 a 8 V), de 0,1 Hz de freqüência e 0,2 mseg de duração. As contrações musculares em resposta a estímulos indiretos foram registradas em fisiógrafo GEMINI 7070 da UGO BASILE através de transdutor isométrico BG-25 GM KULITE da Semiconductor Products Inc. durante 20 ou 120 minutos (Fig. 2.1.). Concentrações de 5, 10, 20, 40, 80 e 100 µg/ml de peçonha total foram adicionados ao banho para a observação de seus efeitos.

Acetilcolina (Ach; 55 µM e 110 µM) e Potássio (K⁺; 13,4 mM ou 26,8 mM) também foram adicionados ao banho antes e depois da adição das diversas doses de peçonha.

Foram feitos também experimentos usando estimulação direta com estímulos supramaximais (20 – 30 V) de 0,1 Hz de freqüência e de 2 mseg de duração. Neste caso, a preparação foi previamente tratada com d-Tubocurarina

(dTc) (5,86 µM) para bloquear as respostas à estimulação indireta. Doses de 5, 10 e 20 µg/ml da peçonha foram adicionados ao banho e registrado os seus efeitos.

Todas as preparações foram subm etidas a um período de estabilização não inferior a 15 minutos previamente à adição das diversas doses de peçonha.

Nos experimentos controle foram adicionados à preparação, 0,2 ml de solução de Krebs.

2.5.2. Preparação Nervo Sensorial de Crustáceo sob Estimulação Indireta: a técnica consistiu na separação de um períopodo ambulatório provocando-se a autotomia por compressão do seu artículo base-ísquio. Como o nervo se encontra na porção central, cada segmento foi retirado por secção das articulações mantendo somente o dáctilo. Este com o nervo apenso foi acondicionado numa câmara com o dáctilo exposto ao ar com as sensilas mecanorreceptoras com a finalidade de serem estimuladas constantemente por gotas de água do mar. O feixe nervoso na sua extremidade foi conectada num eletrodo de sucção. Foi utilizado um pré -amplificador AC (P15, Grass Instruments Inc) e um fisiógrafo (DMP – 4B Narco Biosystem) para registro e visualização num osciloscópio (Tektronix 5103). Parte desses equipamentos estavam contidos numa gaiola de Faraday para reduzir a interferência elétrica externa. A preparação foi mantida em solução fisiológica para crustáceo (Fig. 2.2.).

Foram adicionados à câmara 30µg/ml de peçonha de Bothrops leucurus e seu efeito foi observado por 2 horas. Após este tempo, adicionou-se, na mesma câmara mais 30µg/ml de peçonha (total 60µg/ml) e o efeito desta dose foi observado por 30 minutos.

2.5.3. Preparação Nervo Sensorial de Crustáceo sob Estimulação Direta: a técnica consistiu na separação de um períopodo ambulatório provocando-se a autotomia por compressão do seu artículo base-ísquio. Como o nervo se encontra na porção central, cada segmento, inclusive o dáctilo, foi retirado por secção das articulações. O nervo foi acondicionado numa câmara sobre 5 eletrodos, sendo um central terra (GND), dois de estimulação E1 (anodo) e E2 (catodo) ligado ao Estimulador (GRASS SD9) e dois eletrodos de registro R1 e R2 que estavam conectados ao pré -amplificador de sinais AC (P15, GRASS). Todo este aparato estava dentro da gaiola de Faraday evitando, assim, ruídos provenientes do ambiente. Do amplificador a conexão era feita com o osciloscópio (Tektronix 5103) (Fig. 2.3.).

O estímulo foi dado com pulsos supramáximos (freqüência 0,2 Hz, delay de 6 ms e com tempo de duração de 0,06 ms; ganho de amplificação do sinal registrado foi de 100x).

Foram colocados sobre o nervo 10 µg/ml de peçonha de Bothrops leucurus e seu efeito foi observado por 60 minutos. Após este tempo, adicionou-se sobre o mesmo nervo 20 µg/ml (totalizando 30 µg/ml) de peçonha e o efeito foi observado por mais 10 minutos.

Após a observação do efeito da peçonha, ministraram -se a preparação 20 µl de tetrodotoxina (TTx) na concentração de 10^-5 molar e seu efeito foi observado e fotografado por uma câmara digital Mavica FD73 Sony.

2.5.4. Nervo Sensorial de Crustáceo em Preparação de “Sucrose Gap”: a técnica consistiu na separação de um períopodo ambulatório provocando-se a autotomia por compressão do seu artículo base-ísquio. Como o nervo se encontra na porção central, cada segmento, inclusive o dáctilo, foi retirado por secção das articulações. O nervo foi acondicionado numa câmara de “sucrose gap”. Esta técnica consistiu no isolamento elétrico

de uma região do nervo, após as regiões de estimulação, através de lavagens sucessivas com solução de sacarose. Assim os eletrodos posicionados antes e depois da barreira de sacarose registraram o potencial de membrana interna.

A câmara possuía 6 compartimentos escavados com um sulco central unindo-os onde se acondicionava o nervo, sendo que os compartimentos eram isolados uns dos outros por vaselina evitando assim curto no circuito. Os eletrodos de estimulação que eram feitos de platina-irídio ficaram nos compartimentos 1 (eletrodo positivo) e 2 (eletrodo negativo) enquanto os eletrodos de registro feitos de prata cloretada ficaram nos compartimentos 4 e 6, no compartimento 3 era aterrado o sistema. Os compartimentos 1 a 4 continham solução fisiológica para crustáceo (200 µl), o 5 solução de sacarose (200 µl) e o 6 solução de KCl (200 µl). Foram empregados estímulos supramaximais (freqüência 0.2 Hz, duração de 2 ms e delay de 2 ms) através de um estimulador Grass SD-9; o potencial de ação era amplificado por um pré-amplificador DC de alta impedância modelo NF-1 Bioeletric Instruments, a ddp produzido pelo potencial de membrana era monitorado por um voltímetro e os potenciais de ação eram visualizados num osciloscópio 5103 Tektronix e registrados por uma câmara digital Mavica FD73 Sony. Parte dos equipamentos estavam dentro da gaiola de Faraday evitando-se ruído externo (Fig. 2.4.).

Foram adicionados no compartimento 4, 10 µg/ml de peçonha e seu efeito foi observado por 40 minutos e após este tempo adicionaram -se ao mesmo compartimento mais 10 µg/ml de peçonha. O efeito foi então observado durante 10 minutos.

Fig. 2.1: Representação esquemática: montagem eletrofisiológica de uma

preparação biventer cervicis de ave.

EST FIS TR S BM EBC MUSC EBC FIS - Fisiógrafo EST - Estimulador TR - Transdutor

EBC - Eletrodo Bipolar de Campo MUSC - Músculo

BM - Banho-Maria S - Suporte

Fig. 2.2: Representação esquemática: montagem eletrofisiológica de uma

preparação nervo sensorial de crustáceo sob estimulação indireta. FIS OSC PA-AC EI ES AF GA SF FA CN DA GF CN - câmara do nervo

SF - solução fisiológica para crustáceo FA - feixe de axônio

DA - dáctilo

GA - gota de água do mar AF - água do mar filtrada EI - eletrodo indiferente ES - eletrodo de estimulação PA-AC - pré-amplificador AC GF - gaiola de Faraday FIS - fisiógrafo OSC - osciloscópio

Fig. 2.3: Representação esquemática: montagem eletrofisiológica de uma

preparação nervo sensorial de crustáceo sob estimulação direta. EST OSC PA-AC SF FA CN GF R2 R1 Terra (GND) E2 catodo E1 anodo CN - câmara do nervo

SF - solução fisiológica para crustáceo FA - feixe de axônio R1 - eletrodo de registro R2 - eletrodo de registro E1 - eletrodo de estimulação (+) E2 - eletrodo de estimulação (-) ES - eletrodo de estimulação PA-AC - pré-amplificador AC GF - gaiola de Faraday EST - estimulador OSC - osciloscópio

Fig. 2.4: Representação esquemática: montagem eletrofisiológica de uma

preparação nervo sensorial de crustáceo (sucrose gap). EST OSC PA-DC GF VOL ER CN E1 (+) E2 (-) SF SF SF SF K+ SAC Terra CN - câmara do nervo

SF - solução fisiológica para crustáceo FA - feixe de axônio ER - eletrodo de registro E1 - eletrodo de estimulação (+) E2 - eletrodo de estimulação (-) K - solução de KCL isosmótico SAC- sacarose VOL - voltímetro PA-DC - pré-amplificador DC GF - gaiola de Faraday EST - estimulador OSC - osciloscópio + FA