É essencial planejar e conduzir estudos de estabilidade para avaliar a possível instabilidade e atribuir uma vida útil ao material. O ensaio de estabilidade visa determinar o grau de instabilidade remanescente do candidato a MR após a preparação ou confirmar a estabilidade do material. Uma avaliação do estudo de estabilidade é baseada na diferença entre os resultados das medições efetuadas em amostras armazenadas em diferentes tempos, a uma temperatura fixa. Mesmo materiais “estáveis” podem apresentar instabilidade para um ou mais valores de propriedade. Há dois tipos de estabilidade (ou instabilidade) a serem considerados na certificação de materiais de referência: a estabilidade a longo prazo do material (tempo de prateleira) e a estabilidade a curto prazo (estabilidade do material sob “condições de transporte”) (ABNT, 2012; LINSINGER, 2004).
A estabilidade a longo prazo de um material de referência está associada ao comportamento do MR nas prateleiras do produtor. A estabilidade a curto prazo está associada a quaisquer efeitos extras devidos ao transporte das amostras (ABNT, 2012; LINSINGER, 2004).
Segundo o ISO Guia 35, o estudo de estabilidade a curto prazo é tipicamente realizado em diferentes temperaturas a fim de estudar o efeito da temperatura sobre as propriedades do material. As temperaturas das amostras podem variar durante o transporte de -50ºC a +70ºC, dependendo do tipo de embalagem e modalidade de transporte. Com base nos efeitos observados, podem ser definidas as condições de transporte e elaboradas as instruções de embalagem, para efetivamente eliminar quaisquer efeitos secundários indesejáveis. Um estudo de estabilidade a curto prazo leva, tipicamente, 1 a 2 meses, todavia, pode levar mais tempo quando as condições ideais de armazenamento têm que ser simultaneamente determinadas (ABNT, 2012).
Para um modelo bem sucedido de qualquer estudo de estabilidade, é essencial a existência de condições sob as quais o material é definitivamente estável ou em que se pode, pelo menos, assumir que a instabilidade é insignificante (a razão para não armazenar o material nestas condições pode ser financeira, porque as condições de armazenamento são cautelosas). Por questões práticas, as amostras são frequentemente mantidas primeiramente às temperaturas de investigação e depois transferidas para as condições de referência (LINSINGER, 2004).
Um segundo fator importante é a aleatoriedade das medições. Medições não aleatórias podem levar a conclusões totalmente incorretas relativas à estabilidade do material, tal como uma alteração aparente nos valores observados, que pode dever-se a deriva dos resultados de medição em vez de instabilidade do material. Portanto, a seleção
das amostras e a ordem de medições devem ser distribuídas aleatoriamente para fornecer uma visão geral sobre a estabilidade ao longo de todo o lote (LINSINGER, 2004).
A heterogeneidade entre as unidades pode aumentar a variação do valor de propriedade medida durante um estudo de estabilidade, o que leva a uma avaliação mais pobre da estabilidade (LINSINGER, 2004).
O estudo de estabilidade requer um número considerável de frascos (unidades). De preferência, é conveniente que mais de um frasco esteja disponível para cada ponto no tempo. Há dois modelos experimentais básicos para estudos de estabilidade:
o estudo clássico de estabilidade, e o estudo isócrono de estabilidade.
No estudo clássico de estabilidade, amostras individuais preparadas ao mesmo tempo, sob condições idênticas, são avaliadas à medida que o tempo transcorre. O modelo isócrono, proposto por Lamberty; Shimmel e Pauwels (1998), envolve a definição das condições em que o material é considerado como estável. O estado de degradação da amostra pode ser paralisado, armazenando-a sob estas condições. Em seguida, é possível medir todas as amostras de um estudo de estabilidade em condições de repetitividade, em contraste com o estudo de estabilidade clássica, na qual as medições só podem ser realizadas dentro das condições de reprodutibilidade no laboratório, o que leva a uma incerteza relativamente elevada, pois a instabilidade do sistema de medição também está incluída (ABNT, 2012; LINSINGER, 2004).
A abordagem isócrona reduz a dispersão dos pontos ao longo do tempo, aprimorando, assim, a “resolução” do estudo de estabilidade. Como consequência disso, o estudo de estabilidade isócrono, usualmente, leva a uma incerteza menor do que o estudo clássico, dependendo da diferença entre a repetitividade e a reprodutibilidade das medições. Uma desvantagem do modelo isócrono é que os dados de um estudo de estabilidade só se tornarão disponíveis no final do estudo, o que pode, eventualmente, causar atraso na certificação do MR (ABNT, 2012; LINSINGER, 2004; LAMBERTY; SHIMMEL; PAUWELS, 1998).
1.7. Métodos de Caracterização
De acordo com Skoog, Holler e Nieman (2002), a espectrometria de massas, dentre todas as ferramentas analíticas disponíveis, é talvez a de mais ampla aplicabilidade, no sentido da técnica ser capaz de fornecer informações sobre a (s):
1) composição elementar de amostras;
2) estruturas de moléculas inorgânicas, orgânicas e biológicas; 3) composição qualitativa e quantitativa de misturas complexas; e 4) razões isotópicas de átomos nas amostras.
O espectro de massas de uma substância pura fornece vários tipos de dados que são úteis para a sua identificação, como a massa molecular do composto e sua fórmula molecular. A fórmula molecular pode ser determinada a partir do espectro de massas de um composto, uma vez que o pico molecular possa ser identificado e sua massa exata, determinada. Para essa aplicação deve-se utilizar um instrumento de alta resolução, capaz de detectar diferenças de alguns milésimos de unidades de massa (SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002).
A técnica de espectrometria de massas sequencial (MS/MS) consiste na aquisição e estudos de espectros de íons produto e precursores originados a partir de íons selecionados em um primeiro estágio de análise de massas. Em MS/MS os íons gerados em um primeiro estágio da análise de massas são fragmentados por dissociação induzida por colisão (CID), separados de acordo com sua relação massa/carga (m/z) e detectados. O estudo dos padrões de fragmentação mostrados no espectro de massas fornece informações sobre a presença de vários grupos funcionais. Estudos sistemáticos de padrões de fragmentação de substâncias puras levaram a diretrizes racionais para predição de mecanismos de fragmentação e a uma série de regras gerais que são úteis na interpretação dos espectros. Poucas vezes é possível, ou desejável, levar-se em conta todos os picos do espectro. Em vez disso, buscam-se padrões de fragmentação característicos. A identidade real do composto pode frequentemente ser estabelecida pela comparação do seu espectro de massas com os de compostos conhecidos até que um alto grau de coincidência seja conseguido (SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002).
1.7.2. Caraterização do Material de Referência
De acordo com a norma ISO/ Guia 35, a caracterização de um material de referência é a determinação de um ou mais valores de propriedades químicas, físicas, biológicas ou tecnológicas relevantes ao uso pretendido. Quatro formas de caracterização de um material de referência são citadas pela ISO/ Guia 34. Normalmente, elas são empregadas
de diversas maneiras por organismos de certificação e produtores de MR, utilizando-se as seguintes formas de medições:
por meio de um único método de medição (método primário), por um único laboratório;
por dois ou mais métodos de referência independentes em um único laboratório;
por um ou mais métodos de exatidão comprovada, realizadas por uma rede de laboratórios competentes;
envolvendo uma rede de laboratórios competentes utilizando um método de medição específico, que fornece apenas os valores de propriedade específicos do método (ABNT, 2012).