ESTUDO FITOQUÍMICO DAS FOLHAS FRAÇÃO ACETATO DE ETILA (FAA)

O material foi fracionado em cromatografia de camada delgada em coluna recheada com sílica flash (40,0h x 5,0Ø cm) tendo no topo sílica florisil (3,0h x 5,0Ø cm), 1,5 g de FAA foram inicialmente macerados com um pouco de sílica até completa homogeneização e após foi acrescentada no topo da coluna e o sistema foi cromatografado utilizando sistema gradiente de eluição (DCM metanol) de onde foram coletados 23 subfrações que após análise por CCD foram agrupadas em 11 outras e numeradas de FAA1 a FAA11 (Fluxograma 3.1).

FLUXOGRAMA 3.1 – Fracionamento da partição FAA

3.7.1.1. ISOLAMENTO DAS SUBSTÂNCIAS FA1, FA2 E FA3

A fração FAA2 foi novamente refracionada utilizando para isso cromatografia em coluna recheada com sílica flash (30,0h x 4,0Ø cm) tendo como fase móvel uma mistura de hexano/acetona (2:1) (sistema isocrático de eluição) de onde se obteve 14 novas frações e que após análise por CCD (utilizando como revelador, vapor de amônia e vanilina ácida) foram agrupadas em 6 novas frações (Fluxograma 3.2), que foram renomeadas de FAA2.1 a FAA2.6.

FAA (1500mg) FAA3 43mg FAA1 30mg FAA5 50mg FAA7 123mg FAA9 153mg FAA11 132mg FAA4 185mg FAA2 132mg FAA6 103mg 190mg FAA8 FAA10 34mg Sílica flash (40,0h x 5,0Ø cm) (diclorometanol)

FLUXOGRAMA 3.2 – Refracionamento da fração FAA2

Após experimento de RMN 1H verificou-se que as frações FAA2.2 e FAA2.4 apresentavam como uma mistura de duas ou mais substâncias e optou-se por separá-las utilizando cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). As condições de separação para FAA2.2 e FAA2.4 foram: coluna semi-preparativa (30h x 0,78Ø cm) fenil-hexil; modo reverso de eluição: ACN 33% e MeOH 17%; Detector: UV-Vis 254 e 273 nm; Fluxo: 4 mL/min; sistema reciclante; seringa 200 µL num looping de 200 µL.

Para a fração FAA2.2 foram realizadas 8 injeções, o cromatograma (Figura 3.1) mostra o aparecimento de 4 bandas cromatográficas que foram coletadas inicialmente a primeira banda (chamada de A), as segundas e terceiras bandas (chamada de B) e a quarta banda (chamada de C) foi reciclada e após o primeiro reciclo foi coletada. Após, todas as bandas foram agrupadas e renomeadas de FAA2.2A, FAA2.2B e FAA2.2C após estarem secas foi realizado experimento de

1_{H RMN onde se constatou que FAA2.2C era uma substância pura (FA1).}

FAA2 132mg FAA2.2 49mg FAA.2.1 11mg FAA2.3 10mg FAA2.4 37mg Sílica Flash(30h x 4,0Ø cm) hexano/acetona 2:1 FAA2.5 5mg FAA2.6 7mg FAA.2.2

A 10mg FAA.2.2 B 12mg FAA.2.2 C 25mg FAA.2.4 A 7mg FAA.2.4 B 3mg FAA.2.4 C 11mg FAA.2.4 D 12mg

0 2 4 6 8 10 12 0 100 200 D Abs Tempo A B C D

FIGURA 3.1 – Cromatograma de CLAE da fração FAA2.2.

Para a fração FAA2.4 foram realizadas 12 injeções. O cromatograma (Figura 3.2) mostra o aparecimento de 4 bandas cromatográficas que foram coletadas: inicialmente a primeira banda (chamada de A), a segunda banda (chamada de B) e a terceira banda (chamada de C) e a quarta banda (chamada de D) foram recicladas e após o primeiro reciclo foram coletadas. Após, todas as bandas foram agrupadas e renomeadas de FAA2.4A, FAA2.4B, FAA2.4C e FAA2.4D. Após estarem secas foi realizado experimento de RMN de 1H onde se constatou que FAA2.4C e FAA2.4D eram substâncias puras (FA2 e FA3 respectivamente). 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 20000 40000 C D D A C Abs tempo B

3.7.1.2. ISOLAMENTO DA SUBSTÂNCIA FA4

A fração FAA3 foi cromatografada em coluna de sephadex LH-20 (40h x 4Ø cm) tendo como eluente metanol 100%. 43 mg do material foi solubilizado em uma quantidade mínima de metanol (necessário para solubilizar) e aplicada no topo da coluna. Foram coletadas 25 frações que, após análise por CCD, foram agrupadas em outras 5 e nomeadas de FAA3.1 a FAA3.5 (Fluxograma 3.3). A fração FAA3.3 apresentou-se como um sólido de coloração branca e após experimento de RMN 1H verificou-se tratar de uma substância pura (FA4).

FLUXOGRAMA 3.3 – Refracionamento da fração FAA3

3.7.1.3. ISOLAMENTO DAS SUBSTÂNCIAS FA5 E FA6

A fração FAA4 apresentou-se como uma pasta oleosa de coloração verde e após experimento de RMN 1_{H o material foi recromatografado por}

cromatografia de camada delgada em coluna recheada com sílica flash (25,0h x 5,0Ø cm) tendo no topo sílica florisil (2,0h x 5,0Ø cm). 185 g de FAA4 foram inicialmente macerados com um pouco de sílica e sílica florisil até completa homogeneização e após foi acrescentada no topo da coluna e o sistema foi cromatografado utilizando sistema isocrático de eluição tendo como fase móvel uma mistura de hexano/acetona (3:1), de onde foram coletados 25 subfrações que após análise por CCD (vapor de amônia e vanilina ácida) foram agrupadas em 8 outras e numeradas de FAA4.1 a FAA4.8.

A fração FAA4.3 apresentou características de urushióis e novamente foi cromatografada por cromatografia em coluna recheada com sílica flash (12,0h x 2,0Ø cm). 88 g de FAA4.3 foi macerado em sílica flash até completa homogeneização e após foi acrescentada no topo da coluna tendo como fase móvel mistura de Acetato de etila/hexano (2:1), foram coletadas 7 novas frações que após

FAA3 43mg FAA3.2 5mg FAA3.1 7mg FAA3.3 12mg FAA3.4 8mg Sephadex(40h x 4,0Ø cm) metanol FAA3.5 6mg

análise por CCD (vapor de amônia) foram agrupadas em 4 outras e numeradas de FAA4.3.1 a FAA4.3.4 (Fluxograma 3.4).

FLUXOGRAMA 3.4 – Refracionamentos da fração FAA4 e FAA4.3

A fração FAA4.3.3 apresentou-se como um óleo de coloração esverdeado e após RMN 1H mostrou-se como uma mistura de duas substâncias cuja classe pertence a lipídios catecólicos que foram analisadas por cromatografia gasosa acoplada a espectroscopia de massas (CG-EM), porém antes as substâncias precisaram ser derivatizadas em suas hidroxilas fenólicas para éteres silílicos (Box 1). As condições de injeção no GC-EM foram: temperatura do injetor 250 0_{C, temperatura do detector 280} o_{C, e a rampa de aquecimento 50} 0_{C/1min, 5} o_C

até 260 0C por 30 minutos e 15 oC até 290 0C por 20 minutos (Figura 3.3), o tempo de retenção das substâncias foram de 27,24 min para o composto 1 e 27,28min para o composto 2 que correspondem as substâncias FA5 e FA6.

FIGURA 3.3 - Cromatograma gasoso da fração FAA4.3.3. FAA4 185mg FAA4.3 88mg Sílica flash (30h x 4,0Ø cm) hexano/acetona 2:1 Sílica flash (30h x 4,0Ø cm) hexano/acetona 2:1 FAA4.4 9mg FAA4.5

12mg FAA4.6 9mg FAA4.7 5mg FAA4.8 6mg FAA4.1

8mg

FAA4.2 23mg

FAA4.3.1

BOX 1 - Procedimento para preparação dos derivados silílicos.

Preparo dos éteres silílicos

Em um eppendorf, foi acrescentado um equivalente da mistura de lipídios catecólicos dissolvidos em DCM, em seguida foi acrescentado 3 equivalentes de piridina. O sistema reacional foi fechado e a mistura foi aquecida a uma temperatura de 60 o_{C por 5 minutos, após foi acrescentado 3 equivalentes de}

agente sililante, N,N-Dimethyltrimethylsilylamine e aquecido por mais 10 minutos. Após foi realizado a extração do sistema com ciclohexano e esta solução foi injetada no CG-EM.