Estudo in vitro 1 Amostras

Colocou-se um cilindro em cada microtubo (tipo Eppendorf), sendo que cada um destes possui um volume de 1,50 mL (Figura 11).

Figura 11 – Amostra cilíndrica e microtubo.

A quantidade total de cilindros utilizados neste ensaio de absorção in vitro foi de 106, divididos em 18 grupos de 6 amostras cada. Dos 18 grupos, 6 foram grupos controles, sendo 3 deles com amostras de PVDF e os outros 3 com amostras de P(VDF-TrFE) puros em formato cilíndrico. Os 12 grupos restantes correspondem às proporções de materiais, ou seja, 9 para o PVDF/amido nas proporções 66/33, 80/20 e 90/10 e 3 para o P(VDF-TrFE)/amido na proporção 66/33. Os 18 grupos foram ainda separados em 3 períodos de implantes: 14, 28 e 42 dias. A separação dos grupos para cada período de implante ocorreu da seguinte forma:

- 1 grupo controle com 6 cilindros de PVDF.

- 1 grupo controle com 6 cilindros de P(VDF-TrFE). - 1 grupo com 6 cilindros de PVDF/amido 66/33. - 1 grupo com 6 cilindros de PVDF/amido 80/20. - 1 grupo com 6 cilindros de PVDF/amido 90/10.

2.3.2 Meio fisiológico

O sistema de tamponamento selecionado para o ensaio enzimático de degradação in vitro foi o tampão fosfato salino (Phosphate Buffered Saline - PBS). Uma solução fisiológica que mimetiza a concentração salina do soro humano (0,10 M pH = 7,40), tendo a seguinte composição em sais:

- 1,91 g/L de fosfato monossódico (NaH2PO4) anídrico. - 11,94 g/L de fosfato disódico (Na2HPO4) anídrico. - 7,20 g/L de cloreto de sódio (NaCl).

- 0,02 % w/v de azida sódica (NaN3).

Na formulação da solução tampão escolheu-se utilizar o fosfato de sódio por ser um reagente com elevada capacidade de tamponamento que é amplamente utilizada na biologia molecular, bioquímica e cromatografia. A maioria das soluções tampão de sódio fosfato neutro é constituída por misturas das formas monobásico (NaH2PO4)e dibásico (Na2HPO4) em diferentes graus, dependendo do pH desejado. A azida sódica foi adicionada para impedir o crescimento microbiano (AZEVEDO, SANTOS, REIS, 2008; MARTINS et al., 2009). Os microtubos foram imersos em um banho ultratermostatizado (Empresa Marconi, modelo MA-184, -10 a 100 °C) na temperatura de 37,00 ± 1,00 °C. A temperatura utilizada foi escolhida por estar dentro do limite fisiológico do corpo humano (ARAÚJO, CUNHA, MOTA, 2010).

2.3.3 Enzima α-amilase

A concentração de α-amilase geralmente encontrada no plasma de sangue humano, em adultos saudáveis, está na faixa de 46 a 244 unidades (U) por litro (MARTINS et al., 2009). Neste trabalho o valor adotado para concentração de α- amilase foi de 150 U/L, escolhido por ser próximo ao valor médio (145 U/L) da faixa de referência citada acima.

A enzima utilizada foi a α-amilase oriunda da saliva humana, tipo IX-A, em forma de pó liofilizado com massa de 2,39 mg e 210,00 U/mg de pó (Sigma referência A0521). A solução enzimática apresenta uma atividade 2400,00 U/mg de proteína, de acordo com o fabricante. Por definição do fabricante uma unidade (U) libera 1,00 mg de maltose a partir do amido em 3 minutos em um pH de 6,90 a temperatura de 20 °C.

Para a produção da solução enzimática que foi adicionada ao tampão PBS procedeu-se da seguinte maneira:

- Primeiramente determinou-se a concentração de α-amilase (U) por mL e o valor encontrado foi de 0,15 U/mL.

- Com este valor e com o de 210,00 U/mg de pó procedeu-se o cálculo da quantidade de α-amilase em mg de pó por mL. O valor encontrado foi de 7,14*10-4 _mg/mL.

- De posse deste último valor e da quantidade em gramas de α-amilase (2,39 mg), obteve-se o valor em mL de solução tampão que deveria ser preparada. O resultado obtido foi de 3347,37 mL. Para evitar a preparação de uma grande quantidade de solução tampão, diluiu-se os 2,39 mg de pó liofilizado em 33,47 mL, ou seja, um solução 100 vezes mais concentrada. - Obteve-se então 33 microtubos do tipo Eppendorf de 1,00 mL com solução

de α-amilase em tampão PBS com concentração de 15,00 U/mL, os quais foram armazenados em congelador (-20 °C).

- Para cada ensaio in vitro, um microtubo contendo 1,00 mL da solução enzimática foi adicionado a 99,00 mL da solução tampão PBS, assim o valor de concentração de 0,15 U/mL foi alcançado. A solução foi homogeneizada cuidadosamente devido à fragilidade da enzima.

- Finalmente o conteúdo desta solução foi transferido para os microtubos contendo as amostras.

2.3.4 Esterilização por óxido de etilieno

Na esterilização das amostras e dos microtubos a técnica utilizada foi a de esterilização por óxido de etileno (EtO). A esterilização foi realizada na empresa OXETIL Ltda. A seguir estão os parâmetros aplicados ao protocolo de esterilização:

- Tempo total do ciclo de esterilização: 5 horas ± 30 minutos.

- Gás utilizado: EtO (de acordo com a portaria interministerial n° 482 de 16/04/1999).

- Vácuo inicial: -0,55 ± 0,10 bar.

- Tempo de condicionamento: 10 ± 1 minutos. - Tempo de pressurização: 1 a 5 minutos.

- Temperatura: 37,00 a 63,00 °C. - Umidade relativa: 40,00 a 80,00 %. - Vácuo final: -0,50 ± 0,10 bar.

- Aeração mecânica: 60,00 ± 10,00 minutos (composto por N2, aeração e hiperventilação).

- Aeração mecânica forçada: PO-07.021.

- Indicador biológico: Attest marca 3M – lote 2012-11 AA (esporos de

Bacillus atrophaeus ATCC 9372), resultado negativo.

- Indicador químico multiparamétrico (Comply) e indicador químico (fita Indox): Dentro dos padrões indicativos de esterilização eficiente.

- Cilindro de EtO: 041 (lote do gás).

- Concentração de EtO: 450 a 1200 mg/L, em conformidade com ANSI/AAMI ST 41:1999, 2000 Association for the Advancement of Medical

Instrumentation.

2.3.5 Secagem das amostras

Após o ensaio in vitro, realizou-se o processo de secagem das amostras, o qual consistiu da seguinte sequência de procedimentos: cada amostra foi lavada quatro vezes sucessivas com água deionizada; em seguida realizou-se a secagem com lenço de papel; mais quatro banhos sucessivos com álcool etílico absoluto (99,95%) com a duração de 1 hora cada e secagem com lenço de papel.

2.3.6 Cálculo da perda de massa

As amostras tiveram a sua massa medida com uma balança de precisão da marca Shimadzu do Brasil, modelo AUW220D. Tal medição foi realizada em dois momentos, antes e após o período de ensaio in vitro. Porém na segunda medida, antes da medição das massas, procedeu-se o processo de secagem das amostras. Para a obtenção da perda de massa percentual foi empregada a seguinte equação:

2.3.7 Análise estatística

A análise estatística foi aplicada com o objetivo de verificar se houve diferenças significativas entre as medidas das massas inicial e final dos seis tipos de composições nos períodos de 14, 28 e 42 dias de experimento de degradação do amido. Devido ao fato do tamanho amostral de cada um dos grupos não ser suficientemente grande, igual a seis em cada período, aplicou-se o teste não paramétrico de Wilcoxon, que não exige as pressuposições que os testes paramétricos estabelecem (distribuição Normal). Outro motivo para a utilização do teste de Wilcoxon é que este tem aplicação na comparação de duas amostras de dados pareadas, ou seja, dependentes (FIELD, 2009). Os testes foram realizados no programa computacional SPSS. Para a execução da análise foi utilizado um nível de significância de 0,05 (5 %). As hipóteses do teste são descritas como:

- H0: as medidas das massas não diferem estatisticamente (inicial e final). - H1: as medidas das massas diferem estatisticamente (inicial e final).

Na secção 4.1 encontram-se os resultados que apresentaram significância estatística, além destes também serão apresentados resultados que consideramos relevantes. Os resultados serão apresentados por tabelas das massas final, inicial e percentual de perda de massa das amostras.