Estudo in vivo

2.4.1 Animais de experimentação

Nesse trabalho foram utilizados 18 ratos machos da linhagem Wistar (Rattus novergicus, variedade albina, Rodentia, Mammalia) com idade de 120 dias, obtidos junto à Universidade do Oeste Paulista (UNOESTE). Os animais ficaram mantidos no biotério do laboratório de histologia da FCT/UNESP em gaiolas individuais suspensas, sob condições de temperatura ambiente média de 22,00 ± 2,00 °C e alimentados com ração padrão (marca Primor, ração para coelhos e roedores) e água potável fornecida ad libitum. O presente estudo foi aprovado pelo Comissão de Ética no Uso de Animais da FCT/UNESP, Presidente Prudente, São Paulo, Brasil (processo nº 02/2014 – Anexo II) e foi conduzido de acordo com as recomendações do National Institutes of Health (NIH).92

2.4.2 Modelo experimental

Os animais foram submetidos a processo cirúrgico para a implantação das amostras. As amostras utilizadas foram as de PLA; PLA/amido na proporção 90/10 e; PLA/amido/SEP na proporção 89/10/1. A distribuição, descrição e quantidade de animais por grupo encontram- se na Tabela 7.

Tabela 7 – Distribuição, descrição e quantidade de animais no estudo in vivo

Amostra Número de animais

PLA espumada em forno 3

PLA espumada em banho de glicerina 3

P10A espumada em forno 3

P10A espumada em banho de glicerina 3

P10AS espumada em forno 3

P10AS espumada em banho de glicerina 3

2.4.3 Esterilização por óxido de etileno (EtO)

Na esterilização das amostras a técnica utilizada foi a EtO. Para verificar a permanência do óxido de etileno no interior das amostras, uma análise residual por cromatografia gasosa foi realizada (Anexo III).

A esterilização foi realizada na empresa OXETIL Ltda. A seguir estão os parâmetros aplicados ao protocolo de esterilização:

 Tempo total do ciclo de esterilização: 5 horas ± 30 minutos;

 Gás utilizado: EtO (de acordo com a portaria interministerial n° 482 de 16/04/1999);

 Vácuo inicial: -0,55 ± 0,10 bar;

 Tempo de condicionamento: 10 ± 1 minutos;  Tempo de pressurização: 1 a 5 minutos;

 Tempo de fase de esterilização: 210 ± 1 minutos;  Temperatura: 37,00 a 63,00 °C;

 Umidade relativa: 40,00 a 80,00 %;  Vácuo final: -0,50 ± 0,10 bar;

 Aeração mecânica: 60,00 ± 10,00 minutos (composto por N2, aeração e hiperventilação);

 Aeração mecânica forçada: PO-07.021;

 Indicador biológico: Attest marca 3M (esporos de Bacillus atrophaeus ATCC 9372), resultado negativo;

 Indicador químico multiparamétrico (Comply) e indicador químico (fita Indox): Dentro dos padrões indicativos de esterilização eficiente;

 Concentração de EtO: 450 a 1200 mg/L, em conformidade com ANSI/AAMI ST 41:1999, 2000 Association for the Advancement of Medical Instrumentation. 2.4.4 Procedimentos cirúrgicos

Os animais permaneceram em jejum pré-operatório de 8 horas, sendo a seguir submetidos à anestesia por meio de injeção intramuscular de cloridrato de ketamina (50,0 mg/mL) e cloridrato de xilazina (20,0 mg/mL) na dose de 25,0 mg/Kg e 3,0 mg/Kg.93 _A manutenção do plano anestésico, quando necessário, foi feita com a utilização de injeção intramuscular de ketamina com metade da dose inicial. Antes da cirurgia de implantação das amostras realizou-se a tricotomia da pata posterior direita. Em seguida toda a área foi lavada com solução de Polvedine e posteriormente com solução de álcool iodado a 2 %, seguindo-se o isolamento da área cirúrgica por meio de campos estéreis. As incisões foram realizadas com

a utilização de bisturi, lâmina n° 22, utilizando-se uma via de acesso medial, na pata posterior direita entre os músculos tibial posterior - tibialis posteriori e tríceps sural - triceps surae. Após o implante foram realizadas suturas dos planos musculares e da pele com fio mononylon 4-0 (Figura 6).

Figura 6 – Procedimento cirúrgico de implantação da amostra. Em destaque a região na qual foi realizada a tricotomia isolada por campos estéreis (a); incisão dos tecidos epitelial e muscular (b-c); alargamento do espaço intramuscular (d); implantação das amostras nos animais (e); suturas realizadas após a cirurgia no plano muscular (f) e plano da pele (g) e limpeza com a com solução de álcool iodado a 2 % (h).

2.4.5 Coleta do material

Para a coleta do material, após 40 semanas contadas a partir da data da cirurgia de implantação das amostras, os animais permaneceram em jejum pré-operatório de 8 horas e sofreram eutanásia, por meio de uma superdose do anestésico pentobarbital sódico via intraperitoneal (150,0 a 200,0 mg/Kg), com a devida observação da cessão dos batimentos cardíacos para prontamente iniciar o procedimento cirúrgico.93,94 _{Esse consistiu da retirada da} pele da região medial da pata traseira direita, expondo a região onde as amostras foram implantadas. As amostras e os tecidos musculares adjacentes (Figura 7) foram retirados e imediatamente armazenados em formol à 10 %. Em seguida foram encaminhados para os procedimentos histológicos e posterior análise. A Figura 7 apresenta uma amostra que foi implantada e removida após o período de estudo estipulado.

Figura 7 – Amostra removida da pata traseira dos animais após o período de 40 semanas. 2.4.6. Descrição da técnica para corte histológico

Os procedimentos histológicos foram realizados no laboratório HISTOCELL – Soluções em Anatomia Patológica, São Paulo. Nesse laboratório no momento do recebimento das amostras essas foram avaliadas tecnicamente e utilizadas de forma total ou parcial, de acordo com a representatividade necessária.

Em seguida os fragmentos foram inseridos em um cassete com a devida identificação do órgão. Na sequência as amostras foram submetidas a um procedimento de desidratação passando por 1 hora em álcool 70 %, depois em álcool 96 % e por fim em álcool absoluto. Em seguida foram colocadas no reagente xilol onde permaneceram por 2 horas e depois colocadas em um banho de parafina por um período mínimo de 3 horas. Após a conclusão desse processo foi feita a inclusão das amostras no próprio cassete de forma que os fragmentos estivessem na posição ideal para os cortes histológicos.

As amostras foram conferidas com a ordem de serviço do laboratório e colocadas em uma bandeja com gelo para mantê-las devidamente resfriadas. Em seguida as lâminas foram identificadas com as mesmas identificações dos cassetes. Esses com as amostras foram então colocados no equipamento denominado micrótomo onde foram feitos os cortes seriados entre 3 ou 4 micrometros e as fitas produzidas neste processo foram colocadas em um banho-maria com temperatura de 56 ºC; após estirar as fitas no banho foram retirados o número de fragmentos necessários e esses foram colocados sobre as lâminas.

Em seguida as lâminas foram para uma estufa com temperatura variável entre 60 ºC e 70 ºC por 30 minutos. Na sequência realizou-se a coloração das lâminas: i) uma sequência com 3 xilóis por 5 minutos para cada cuba; ii) depois imersão rápida em 5 cubas de álcool, lavadas em água corrente por 5 minutos e iii) posterior colocação no corante Hematoxilina (imersão de 1 minuto) e “contra coradas” com Eosina (imersão de 1 minuto).

Para finalizar o processo de coloração realizamos algumas passagens em álcool absoluto e em seguida pelo xilol. As amostras coradas receberam a cobertura de lamínulas para proteção e melhor visualização no microscópio e finalizando as lâminas foram etiquetadas conforme a identificação inicial.

2.4.7 Microscopia Ótica

As lâminas coradas foram destinadas para a análise da morfologia geral dos tecidos a fim de se verificar a biocompatibilidade do material implantado. A análise microscópica qualitativa do padrão de resposta tecidual frente ao implante foi realizada no laboratório de histologia da FCT/UNESP, com a utilização de fotomicroscópio da marca Nikon (modelo Eclipse 50i) acoplado a uma câmera digital da marca Nikon (modelo Infinity 1) e do software NIS Elements D 3.0. As imagens foram processadas usando o software livre GNU Image Manipulation Program (Gimp) versão 2.8.16.

CAPÍTULO III