7 RESULTADOS
7.4 ESTUDO PRELIMINAR DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA DE
7.4 ESTUDO PRELIMINAR DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA DE CAMUNDONGOS
A expressão de IL-17A nos poços estimulados com PPVOi também foi significante, apresentando seu pico de expressão no tempo de 6 dias.
Como era esperado, por não ter havido uma estimulação prévia de PPVOi, o perfil da cinética de expressão de citocinas do grupo de animais infectados e não tratados (gráfico 19) e do grupo de animais tratados apenas com glucantime® (gráfico 120) é semelhante ao perfil de expressão do grupo controle. Porém, é possível observar que os valores de IFN-γ e TNF-α, do grupo de animais tratado apenas com glucantime®, mesmo não havendo estimulação antigênica prévia, mostraram-se aumentados em relação ao grupo controle (figura 18). Igualmente, não houve estimulação na produção de IL-2 e IL-4 nesses grupos.
Com relação à cinética da expressão de citocinas dos grupos de animais que receberam PPVOi in vivo (“PPVOi i.m.”, “PPVOi i.p.” e “PPVOi i.p.+Glucantime®”) pode-se observar a partir da análise das figuras 21, 22 e 23, que a terapia com PPVOi influenciou fortemente a expressão de todas as citocinas, tanto as do perfil Th1, quanto as do perfil Th2 e Th17, quando comparados ao grupo controle (figura 18). Diferentemente dos grupos de animais não estimulados com PPVOi, houve aumento significativo nos níveis de expressão absolutos de IL-2, IL-4 e IL-10 desses grupos. Porém, também é possível observar que, especialmente para IL4 e IL-10, a expressão basal desses grupos, isto é, esplenócitos sem qualquer estímulo na placa, também foi bastante elevada. Além disso, para a IL-4, foi visto que apesar do aumento dessa citocina nesses grupos, este aumento foi fortemente inibido com o passar do tempo pela presença de ConA e de PPVOi na placa. Quando comparamos as duas vias de administração do PPVOi utilizadas neste estudo (intraperitoneal e intramuscular), é possível observar que houve uma maior estimulação na produção de IFN-γ, IL-10 e IL-17A do grupo tratado por via intraperitoneal, em relação ao grupo tratado por via intramuscular.
Figura 16- Gráficos da dosagem de citocinas em sobrenadante de cultura de esplenócitos estimulados com PPVOi: “Animais não-infectados e não tratados (grupo controle)”
Fonte: elaborado pela autora
Legenda: Resultados foram expressos pela média ± desvio padrão. Os dados foram analisados estatisticamente por one-way analysis of variance (ANOVA) baseado nos valores da mediana da intensidade de fluorescência (IMF) do teste. Teste de Bonferroni foi usado para determinar a diferença entre os poços estimulados e não estimulados. (** = p ≤0.01; *** = p ≤0.001).
Figura 17- Gráficos da dosagem de citocinas em sobrenadante de cultura de esplenócitos estimulados com PPVOi: “Animais infectados e não tratados”.
Fonte: elaborado pela autora
Legenda: Resultados foram expressos pela média ± desvio padrão. Os dados foram analisados estatisticamente por one-way analysis of variance (ANOVA) baseado nos valores da mediana da intensidade de fluorescência (IMF) do teste. Teste de Bonferroni foi usado para determinar a diferença entre os poços estimulados e não estimulados. (** = p ≤0.01; *** = p ≤0.001).
Figura 18- Gráficos da dosagem de citocinas em sobrenadante de cultura de esplenócitos estimulados com PPVOi: “Animais infectados e tratados com Glucantime®”
Fonte: elaborado pela autora
Legenda: Resultados foram expressos pela média ± desvio padrão. Os dados foram analisados estatisticamente por one-way analysis of variance (ANOVA) baseado nos valores da mediana da intensidade de fluorescência (IMF) do teste. Teste de Bonferroni foi usado para determinar a diferença entre os grupos. (** = p ≤0.01; *** = p ≤0.001).
Figura 19- Gráficos da dosagem de citocinas em sobrenadante de cultura de esplenócitos re-estimulados com PPVOi: “Animais infectados e tratados com PPVOi via i.m”.
Fonte: elaborado pela autora
Legenda: Resultados foram expressos pela média ± desvio padrão. Os dados foram analisados estatisticamente por one-way analysis of variance (ANOVA) baseado nos valores da mediana da intensidade de fluorescência (IMF) do teste. Teste de Bonferroni foi usado para determinar a diferença entre os grupos. (** = p ≤0.01; *** = p ≤0.001).
Figura 20- Gráficos da dosagem de citocinas em sobrenadante de cultura de esplenócitos re-estimulados com PPVOi: “Animais infectados e tratados com PPVOi via i.p.”
Fonte: Elaborado pela autora.
Legenda: Resultados foram expressos pela média ± desvio padrão. Os dados foram analisados estatisticamente por one-way analysis of variance (ANOVA) baseado nos valores da mediana da intensidade de fluorescência (IMF) do teste. Teste de Bonferroni foi usado para determinar a diferença entre os grupos. (** = p ≤0.01; *** = p ≤0.001).
Figura 21- Gráficos da dosagem de citocinas em sobrenadante de cultura de esplenócitos re-estimulados (ex vivo) com PPVOi: “Animais infectados e tratados com PPVOi i.p. e Glucantime®”
Fonte: elaborado pela autora
Legenda: Resultados foram expressos pela média ± desvio padrão. Os dados foram analisados estatisticamente por one-way analysis of variance (ANOVA) baseado nos valores da mediana da intensidade de fluorescência (IMF) do teste. Teste de Bonferroni foi usado para determinar a diferença entre os grupos. (** = p ≤0.01; *** = p ≤0.001).
Para uma melhor compreensão dos perfis de expressão das citocinas de cada grupo experimental, foi feito uma avaliação individual nos níveis absolutos de cada citocina, isto é, levando-se em consideração os níveis do grupo controle igualmente estimulados com PPVOi. A comparação dos grupos foi realizada separadamente para cada citocina, escolhendo-se o tempo (2, 4, 6 ou 8 dias) em que houve os melhores níveis de expressão da citocina em questão e apenas uma concentração viral (1x107 TCID50/ml) (figuras 21-27).
Abaixo estão os níveis de expressão absoluta de INF-γ nos diferentes grupos juntamente com a estimulação basal da citocina. Este ponto reflete os níveis de expressão após seis dias de estímulo com PPVOi. Podemos observar que o PPVOi foi capaz de estimular a expressão do IFN-γ em níveis significativos em todos os grupos, quando comparados ao grupo controle.
Figura 22- Dosagem de IFN-γ após estimulação ou re-estimulação de células esplênicas com PPVOi.
IFN-g(pg/mL)
Controle
(não-infectados)
Infectados,nãotratados
PPVOi(i.m .)
PPVOi(i.p.)
GlucantimeÒ
PPOVi(i.p.)+GlucantimÒe 0
1 0 0 0 2 0 0 0 3 0 0 0 4 0 0 0 5 0 0 0 6 0 0 0 7 0 0 0
N ã o e s t im u la d o E s t i m u l a d o c o m P P V O i
**
**
**
**
***
Fonte: elaborado pela autora.
Legenda: Células esplênicas foram obtidas de macerado de pool de baços dos diferentes grupos de tratamento e, em seguida, foram estimuladas in vitro por até 6 dias com PPVOi.
Para comparação dos grupos, foram levados em consideração os valores de IFN-γ dos poços estimulados com PPVOi na concentração de 1x107 TCID50/ml no tempo “4 dias”. A dosagem da citocina foi realizada no sobrenadante da cultura usando o kit BD™ CBA mouse e análise de citometria de fluxo. Os grupos foram analisados estatisticamente através do teste ANOVA e teste de Tukey para comparações múltiplas. (** = p ≤0.01; *** = p
≤0.001).
A expressão da IL-2, representada na figura 22, mostra que o estímulo com o PPVOi foi capaz de aumentar significativamente os níveis desta citocina para os grupos estimulados in vivo, em relação a estimulação com PPVOi do grupo controle.
A expressão de IL-2 basal desses grupos também está bastante aumentada.
Quando comparados aos seus respectivos níveis de expressão basal.
Figura 23- Dosagem de IL-2 após estimulação ou re-estimulação de células esplênicas com PPVOi.
IL-2(pg/mL)
Controle
(não-infectados)
Infectados,nãotratados
PPVOi(i.m .)
PPVOi(i.p.)
GlucantimeÒ
PPOVi(i.p.)+GlucantimÒe 0
2 5 5 0 7 5 1 0 0 1 2 5 1 5 0 1 7 5 2 0 0
N ã o e s t im u la d o E s t i m u l a d o c o m P P V O i
**
**
**
Fonte: elaborado pela autora.
Legenda: Células esplênicas foram obtidas de macerado de pool de baços dos diferentes grupos de tratamento e, em seguida, foram estimuladas in vitro por até 6 dias com PPVOi.
Para comparação dos grupos, foram levados em consideração os valores de IL-2 dos poços estimulados com PPVOi na concentração de 1x107 TCID50/ml no tempo “2 dias”. A dosagem da citocina foi realizada no sobrenadante da cultura usando o kit BD™ CBA mouse e análise de citometria de fluxo. Os grupos foram analisados estatisticamente através do teste ANOVA e teste de Tukey para comparações múltiplas. (** = p ≤0.01; *** = p
≤0.001).
Outra citocina de perfil Th1, o TNF-α, apresentou seu pico máximo de expressão após 4 dias de estímulo com PPVOi. O gráfico abaixo mostra que o estímulo viral elevou os níveis de expressão do TNF-α em todos os grupos testados e que os maiores níveis foram detectados nos grupos que foram estimulados in vivo.
Figura 24- Dosagem de TNF-α após estimulação ou re-estimulação de células esplênicas com PPVOi.
TNF-a(pg/mL)
Controle
(não-infectados)
Infectados,nãotratados
PPVOi(i.m .)
PPVOi(i.p.)
GlucantimeÒ
PPOVi(i.p.)+GlucantimÒe 0
2 5 5 0 7 5 1 0 0 1 2 5 1 5 0 1 7 5 2 0 0 2 2 5 2 5 0 2 7 5 3 0 0 3 2 5 3 5 0
N ã o e s t im u la d o E s t i m u l a d o c o m P P V O i
*
***
*
*
***
Fonte: elaborado pela autora.
Legenda: Células esplênicas foram obtidas de macerado de pool de baços dos diferentes grupos de tratamento e, em seguida, foram estimuladas in vitro por até 6 dias com PPVOi.
Para comparação dos grupos, foram levados em consideração os valores de TNF-α dos poços estimulados com PPVOi na concentração de 1x107 TCID50/ml no tempo “4 dias”. A dosagem da citocina foi realizada no sobrenadante da cultura usando o kit BD™ CBA mouse e análise de citometria de fluxo. Os grupos foram analisados estatisticamente através do teste ANOVA e teste de Tukey para comparações múltiplas. (** = p ≤0.01; *** = p
≤0.001).
Dentre as citocinas de perfil Th2, foram quantificados os níveis de IL-4, IL-6 e IL-10. Assim como observado nos níveis das citocinas dos grupos estimulados com PPVOi in vivo, os grupos “PPVOi (i.m.)”, “PPVOi (i.p)” e “PPVOi+Glucantime®”, também apresentaram um aumento no perfil destas citocinas quando comprados ao grupo controle. Este fato é observado com IL-4, porém, quando observamos a estimulação basal de cada grupo, vemos que os níveis de IL-4 dos grupos tratados com PPVOi in vivo estão diminuídos em relação ao basal (figura 24).
Figura 25- Dosagem de IL-4 após estimulação ou re-estimulação de células esplênicas com PPVOi.
IL-4(pg/mL)
Controle
(não-infectados)
Infectados,nãotratados
PPVOi(i.m .)
PPVOi(i.p.)
GlucantimeÒ
PPOVi(i.p.)+GlucantimÒe 0
5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0
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***
***
Fonte: elaborado pela autora.
Legenda: Células esplênicas foram obtidas de macerado de pool de baços dos diferentes grupos de tratamento e, em seguida, foram estimuladas in vitro por até 6 dias com PPVOi.
Para comparação dos grupos, foram levados em consideração os valores de IL-4 dos poços estimulados com PPVOi na concentração de 1x107 TCID50/ml no tempo “3 dias”. A dosagem da citocina foi realizada no sobrenadante da cultura usando o kit BD™ CBA mouse e análise de citometria de fluxo. Os grupos foram analisados estatisticamente através do teste ANOVA e teste de Tukey para comparações múltiplas. (** = p ≤0.01; *** = p
≤0.001).
A figura abaixo mostra a expressão de IL-6. Como observado, houve estimulação na produção de IL-6 em todos os grupos testados. Aqui a expressão também foi maior nos grupos estimulados com PPVOi in vivo. Também, nestes grupos, a expressão basal de IL-6 no tempo estudado estava aumentada em relação aos grupos não-estimulados.
Figura 26- Dosagem de IL-6 após estimulação ou re-estimulação de células esplênicas com PPVOi.
IL-6(pg/mL)
Controle
(não-infectados)
Infectados,nãotratados
PPVOi(i.m .)
PPVOi(i.p.)
GlucantimeÒ
PPOVi(i.p.)+GlucantimÒe 0
2 5 0 5 0 0 7 5 0 1 0 0 0 1 2 5 0 1 5 0 0 1 7 5 0 2 0 0 0 2 2 5 0 2 5 0 0
N ã o e s t im u la d o E s t i m u l a d o c o m P P V O i
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Fonte: elaborado pela autora.
Legenda: Células esplênicas foram obtidas de macerado de pool de baços dos diferentes grupos de tratamento e, em seguida, foram estimuladas in vitro por até 6 dias com PPVOi.
Para comparação dos grupos, foram levados em consideração os valores de IL-6 dos poços estimulados com PPVOi na concentração de 1x107 TCID50/ml no tempo “4 dias”. A dosagem da citocina foi realizada no sobrenadante da cultura usando o kit BD™ CBA mouse e análise de citometria de fluxo. Os grupos foram analisados estatisticamente através do teste ANOVA e teste de Tukey para comparações múltiplas. (** = p ≤0.01; *** = p
≤0.001).
A figura 27 mostra a expressão de IL-10 após 4 das de estímulo in vitro com PPVOi. Também aqui, os níveis de expressão de IL-10 foram maiores nos grupos “PPVOi (i.m.)”, “PPVOi (i.p)” e “PPVOi + Glucantime®”, apresentando níveis significativamente mais elevados do que o grupo controle.
Figura 27- Dosagem de IL-10 após estimulação ou re-estimulação de células esplênicas com PPVOi.
IL-10(pg/mL)
Controle
(não-infectados)
Infectados,nãotratados
PPVOi(i.m .)
PPVOi(i.p.)
GlucantimeÒ
PPOVi(i.p.)+GlucantimÒe 0
2 5 0 5 0 0 7 5 0 1 0 0 0 1 2 5 0 1 5 0 0
N ã o e s t im u la d o E s t i m u l a d o c o m P P V O i
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Fonte: elaborado pela autora.
Legenda: Células esplênicas foram obtidas de macerado de pool de baços dos diferentes grupos de tratamento e, em seguida, foram estimuladas in vitro por até 6 dias com PPVOi.
Para comparação dos grupos, foram levados em consideração os valores de IL-10 dos poços estimulados com PPVOi na concentração de 1x107 TCID50/ml no tempo “4 dias”. A dosagem da citocina foi realizada no sobrenadante da cultura usando o kit BD™ CBA mouse e análise de citometria de fluxo. Os grupos foram analisados estatisticamente através do teste ANOVA e teste de Tukey para comparações múltiplas. (** = p ≤0.01; *** = p
≤0.001).
Com relação ao perfil da citocina IL-17, é possível observar que houve a expressão da citocina em todos os grupos estudados e que esta expressão estava aumentado com relação aos controles basais. No entanto, apenas os grupos “PPVOi (i.p.)” e “PPVOi+Glucantime®” tiveram sua expressão aumentada em relação ao grupo de tratamento controle. Os grupos tratados in vivo com a partícula viral inativada, apresentaram níveis de expressão maiores quando re-estimulados, do que o grupo não tratado e tratado apenas com Glucantime®. Também, os níveis basais desta citocina nesses grupos também estavam aumentados.
Figura 28- Dosagem de IL-17A após estimulação ou re-estimulação de células esplênicas com PPVOi.
IL-17A(pg/mL)
Controle
(não-infectados)
Infectados,nãotratados
PPVOi(i.m .)
PPVOi(i.p.)
GlucantimeÒ
PPOVi(i.p.)+GlucantimÒe 0
2 5 0 5 0 0 7 5 0 1 0 0 0 1 2 5 0 1 5 0 0 1 7 5 0
N ã o e s t im u la d o E s t i m u l a d o c o m P P V O i
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Fonte: elaborado pela autora.
Legenda: Células esplênicas foram obtidas de macerado de pool de baços dos diferentes grupos de tratamento e, em seguida, foram estimuladas in vitro por até 6 dias com PPVOi.
Para comparação dos grupos, foram levados em consideração os valores de IL-17A dos poços estimulados com PPVOi na concentração de 1x107 TCID50/ml no tempo “6 dias”. A dosagem da citocina foi realizada no sobrenadante da cultura usando o kit BD™ CBA mouse e análise de citometria de fluxo. Os grupos foram analisados estatisticamente através do teste ANOVA e teste de Tukey para comparações múltiplas. (** = p ≤0.01; *** = p
≤0.001).