Estudo sobre o efeito da Margatoxina nas correntes de K + activadas por voltagem

A MgTX inibe significativamte as correntes de K+ dependentes-da-voltagem. Para a determinação do efeito da MgTx sobre as correntes de K+ utilizaram-se os resultados obtidos em 33 células isoladas da região CA1 do hipocampo de ratos wistar. Os registos foram realizados na configuração whole-cell voltage-clamp. O estudo foi realizado em animais em pós-prandial e em jejum. Para os neurónios provenientes de animais que se encontravam em período de pós-prandial (―neurónios em pos-pradnial‖), foram utilizadas as seguintes concentrações de MgTx: 100fM, 10pM, 100pM, 1nM, 3nM e 10nM. Para neurónios provenientes animais em jejum (―neurónios em jejum‖), apenas foram utilizadas concentrações de 100pM e de 3nM.

1.1.1. Efeito da MgTx nas correntes de K+ - neurónios isolados da zona CA1 do hipocampo de animais em período de pós-prandial

Após a adição de MgTx, observa-se uma diminuição da corrente de K+. No entanto, o efeito é específico para a componente lenta da corrente (Islow), uma vez que a componente

rápida (Ifast) permanecia inalterável. Este facto é expectável, visto que a MgTx é um inibidor

selectivo dos canais Kv1.3. Canais estes caracterizados por despoletarem correntes com taxas de inactivação também lentas, idênticas a Islow (ver em baixo secção 1.1.4). Como se pode

verificar pelas figuras 4.1 a 4.3, a diminuição da componente Islow era tanto maior quanto maior

fosse a concentração de MgTx adicionada. A concentrações maiores, por exemplo [MgTx]=3nM, ocorre também uma aparente e pequena diminuição da Ifast. No entanto, esta é

diminuta quando em comparação com a observada em Islow. O efeito em Ifast é negligenciável

considerável pode, per se, resultar numa redução do pico da corrente total, medida usada para se quantificar a amplitude de Ifast.

Em seguida, são apresentados exemplos dos efeitos nas correntes obtidas e da variação da Islow, assim como a variação das amplitudes da corrente ao longo do decorrer das

experiências (time-course). Os resultados apresentados nas figuras 4.1 a 4.3 correspondem a concentrações ―chave‖ na relação dose-resposta (Figura 4.4). É de assinalar o facto que a inibição provocada pela MgTx não era reversível com a remoção da mesma da solução de perfusão (resultados não ilustrados).

Figura 4.1- Efeito de 100fM de MgTx na corrente total de K+- registo de whole-cell voltage-clamp em neurónios piramidais isolados da zona CA1 do hipocampo de um animal no período de pós-prandial. a) variação da amplitude de Islow ao longo da experiência; b) corrente total de K+ antes e após adição, as correntes foram despoletadas

por um pulso despolarizante a +50mV precedido de um pré-pulso a -120mV, o holding-potencial foi de -50mV; c) subtracção das correntes. Legenda: antes da adição de MgTx (t=330s); após adição de MgTx (t=810s).

Figura 4.2- Efeito de 100pM de MgTx na corrente total de K+- registo de whole-cell voltage-clamp em neurónios piramidais isolados da zona CA1 do hipocampo de um animal no período de pós-prandial. a) variação da amplitude de Islow ao longo da experiência; b) corrente total de K+ antes e após adição, as correntes foram despoletadas

por um pulso despolarizante a +50mV precedido de um pré-pulso a -120mV, o holding-potencial foi de -50mV; c) subtracção das correntes. Legenda: antes da adição de MgTx (t=360s); após adição de MgTx (t=750s).

Figura 4.3- Efeito de 3nM de MgTx na corrente total de K+_{- registo de whole-cell voltage-clamp em neurónios}

piramidais isolados da zona CA1 do hipocampo de um animal no período de pós-prandial. a) variação da amplitude de Islow ao longo da experiência; b) corrente total de K

+

antes e após adição, as correntes foram despoletadas por um pulso despolarizante a +50mV precedido de um pré-pulso a -120mV, o holding-potencial foi de -50mV; c) subtracção das correntes. Legenda: antes da adição de MgTx (t=330s); após adição de MgTx (t=900s).

Como se pode observar pelas figuras 4.1 a 4.3, o efeito inibitório na corrente aumenta com a concentração da MgTx, produzindo um efeito quase nulo à concentração de 100fM (Figura 4.1) e atingindo uma % de inibição de Islow de cerca de 31,69% à concentração de 3nM (Figura 4.3). O efeito verifica-se sobretudo na componente Islow, permanecendo a Ifast

praticamente inalterada. A Tabela 4.1 apresenta os valores obtidos de % de inibição por parte da MgTx para cada concentração utilizada. A Figura 4.4 apresenta a relação dose-resposta. Os pontos da curva foram ajustados com uma função de Hill na qual o valor de EC50foi de 125pM.

Tabela 4.1- Efeito da MgTx na componente Islow das correntes de K

+

de neurónios piramidais isolados da região CA1 do hipocampo de ratos em período de pós-prandial

[MgTx] Número de

amostras

% de inibição da Islow Erro

padrão 100fM 2 3,18 2,18 10pM 6 9,59 2,20 100pM 5 14,46 3,27 1nM 3 22,23 0,72 3nM 4 32,10 4,22 10nM 3 35,39 8,79 a) b) a) b)

Figura 4.4- Ilustração da relação dose-resposta da MgTx na componente lenta (Islow) das correntes de K +

de neurónios piramidais isolados da zona CA1 de hipocampos de ratos wistar em pó-prandial. Os pontos foram ajustados com uma função de Hill, cujos parâmetros coeficiente de Hill e EC50 foram de 0,65 e de 125pM respectivamente.

Legenda: erro padrão; ajustamento com função de Hill.

Os dados obtidos foram analisados através de um teste One-Way ANOVA, mostrando que o efeito produzido por concentrações mais baixas de MgTx, 100fM, 10pM e 100pM, é significativamente diferente daquele produzido pelas concentrações mais elevadas, 3nM e 10nM. Ou seja, comprova-se que o efeito da MgTx aumenta à medida que se aumenta a sua concentração.

1.1.2. Efeito da MgTx nas correntes de K+ - neurónios piramidais isolados da zona CA1 do hipocampo de animais em período de jejum

Os resultados apresentados para as experiências com ―neurónios em jejum‖ são provenientes de 11 animais. Foram unicamente testadas as concentrações de MgTx de 100pM e de 3nM. Ou seja, uma concentração relativamente baixa mas que dá um efeito mensurável nos ―neurónios em pós-prandial‖ (100pM), e, outra concentração considerável (3nM) com efeito quase máximo nos ―neurónios em pós-prandial‖. A Figura 4.5 ilustra as correntes obtidas numa das experiências bem como a variação temporal de Islow. O efeito de 3nM de MgTx em Islow no

Figura 4.5- Efeito de 3nM de MgTx na corrente total de K+_{- registo de whole-cell voltage-clamp em neurónios}

piramidais isolados da zona CA1 do hipocampo de um animal no período de jejum. a) variação da amplitude de Islow ao

longo da experiência; b) corrente total de K+ antes e após adição, as correntes foram despoletadas por um pulso despolarizante a +50mV precedido de um pré-pulso a -120mV, o holding-potencial foi de -50mV; c) subtracção das correntes. Legenda: antes da adição de MgTx (t=585s); após adição de MgTx (t=1215s).

A Tabela 4.2 apresenta os resultados obtidos para as experiências realizadas em ―neurónios em jejum‖. Tal como nas experiências em ―neurónios em pós-prandial‖, a % de inibição da componente Islow aumenta com o aumento de concentração de MgTx. A

componente Ifast permanece, uma vez mais, quase inalterada, como se pode observar na

Figura 4.5. A comparação dos resultados obtidos nesta experiência com aqueles apresentados na Figura 4.4, nota-se bem o efeito menor provocado pela MgTx, em ―neurónios em jejum‖.

Também é conveniente dizer que no caso de algumas das experiências realizadas, principalmente no caso da concentração mais baixa, 100pM, o efeito quer na Ifast quer na Islow é

nulo ou muito próximo de 0, daí a dispersão dos valores.

Tabela 4.2-

+

de neurónios piramidais isolados da região CA1 do hipocampo de ratos em período de jejum

[MgTx]

Número de

amostras