Para obtenção de colônias jovens, o microrganismo foi inoculado em placas de Petri com nove centímetros de diâmetro, contendo o meio de cultura BDA. As placas foram incubadas em uma câmera de crescimento a 27 °C durante cinco a sete dias.
3.5.2 Meios de cultura e fermentação
Para o cultivo em pequena escala foram testados oito meios de cultura, disponíveis em nosso laboratório, a fim de se avaliar o meio de cultura ótimo para a produção de metabólitos secundários pelo microrganismo em estudo. Destes, apenas um era sólido, o meio de cultura arroz, conforme mostra a Tabela 02.
43 Tabela 04. Meios de cultura selecionados para cultivo em pequena escala
Meio de cultura Composição
Caldo de batata e dextrose (BD) Fécula de batata, Dextrose; 30% Caldo de extrato de Malte (ME) Extrato de Malte; 30% Caldo de extrato de malte e dextrose
(MED)
Extrato de Malte, Dextrose; 30% Caldo de extrato de levedura (YE) Extrato de Levedura;
10% Caldo de extrato de levedura e
dextrose (YED)
Extrato de Levedura, Dextrose; 10% Caldo de CZAPECK enriquecido com
2% de extrato de levedura (CZ) czapeck Caldo de farinha de arroz (RD) Farinha de Arroz,
Dextrose; 30%
Arroz (R) Arroz; 90%
Após a reativação do microrganismo, descrita no item 3.5.1, foram preparados os meios de cultura selecionados segundo receita.
Para cada meio de cultura testado foram preparados cinco frascos de Erlenmeyer com capacidade de 1L, nos quais foram transferidos 300 mL de meio de cultura. Os mesmos foram autoclavados durante 20 min. (meio líquido) e 40 min. (meio sólido), esperou-se a resfriação dos frascos de Erlenmeyers e então foi realizada a inoculação do microorganismo. Um frasco de Erlenmeyer, de cada meio estudado foi reservado para o controle (branco).
Após a inoculação os frascos de Erlenmeyer foram incubados a temperatura ambiente, sobre o abrigo da luz, por 21 dias.
3.5.3 Obtenção dos extratos
Finalizado o período de incubação foi realizada uma filtração a vácuo, com a finalidade de separar o micélio do meio líquido.
44
Para a extração dos metabólitos secundários excretados no meio de cultura foi utilizada a metodologia de partição líquido-líquido. O solvente extrator utilizado foi o acetato de etila. Em um balão de separação de 1L foi adicionado 300 mL do meio de cultura e 300 mL de acetato de etila. Agitou-se o balão por três vezes e esperou-se a separação de duas fases imiscíveis; então recolheu- se a fase orgânica. O procedimento foi repetido por três vezes. A fase em acetato de etila foi concentrada em rotaevaporador e, em seguida, levada ao dessecador, até a obtenção do extrato seco (Figura 12).
A extração dos metabólitos produzidos pelo micélio foi realizada adicionando 200 mL de MeOH e triturando como auxilio do triturador até que o mesmo se tornasse uma farinha fina e então foi deixado em repouso por 72 h. Após esse período, foi feita uma filtração e ao resíduo micelial foi novamente adicionado 200 mL de metanol e deixado em repouso por mais 72 h. Após a remoção do solvente via rotaevaporador os extratos brutos micelial foram reunidos e levados ao dessecador, até a obtenção do extrato seco, como mostra a Figura 12.
Adição de 200mL de MeOH Trituração/ Repouso por 72h Filtração a vácuo
Adição de 200mL de MeOH Trituração/ Repouso por 72h Filtração a vácuo
INÓCULO
FILTRADO MICÉLIO
FASE AQUOSA EXTRATO BRUTO FILTRADO
EXTRATO BRUTO MICELIAL TORTA
EXTRATO BRUTO MICELIAL TORTA
Filtração a vácuo
Partição em AcOEt (3x)
45
A metodologia utilizada para obtenção do extrato no meio sólido de arroz consistiu em adicionar 300 mL de metanol ao frasco de Erlenmeyer contendo o meio, macerar com a ajuda de um bastão de vidro e deixar em repouso por 72h. Seguidamente foi feita uma filtração a vácuo e novamente adicionados 300 mL de metanol ao resíduo e deixado em repouso por mais 72 horas. Os filtrados foram reunidos, e após remoção do solvente via rotaevaporação, obteve-se o extrato seco.
Do cultivo do Curvularia lunata nestes meios de cultura foram obtidos 24 extratos brutos, correspondendo a três extratos para cada meio de cultivo, incluindo o extrato micelial, o filtrado e o controle, com exceção do meio sólido, arroz, que originou apenas dois extratos brutos. As massas obtidas para cada extrato, após secagem, encontram-se discriminadas na Tabela 03.
Tabela 05. Código e massa dos extratos brutos obtidos.
Meio de Cultura Código dos Extratos2 Massa (mg)
MEDB 43,1 MED MEDF 34,1 MEDM 181,7 MEB 59,8 ME MEF 91,5 MEM 141,2 YEDB 14,1 YED YEDF 48,3 YEDM 148,1 YEB 21,9 YE YEF 64,1 YEM 44,2 BDB 9,6 BD BDF 17,3 BDM 138,3 RDB 16,8 RD RDF 184,6 RDM 68,2 CZB 49,5 CZ CZF 69,0 CZM 270,9 RB 58,5 R R1 ---- R2 147,3
46 3.5.4 Análise dos Extratos por Cromatografia em Camada Delgada
A cromatografia em camada delgada (CCD) foi realizada para avaliação analítica qualitativa dos componentes dos extratos. Como suportes foram utilizados cromatofolhas de alumínio e placas de vidro.
Os extratos foram solubilizados em solvente adequado e foram aplicados nas cromatoplacas com auxilio de capilares. Uma vez seca as placas foram inseridas em cubas contendo a fase móvel a ser testada. Várias combinações de solventes foram necessárias para se obter a fase móvel adequada para comparação e separação dos compostos.
Como reagentes reveladores foram utilizados solução de anisaldeido e solução de vanilina-ácido sulfúrico; além destes reveladores, utilizou-se também a lâmpada de radiação ultravioleta (254 e 366 nm) e câmara de vapor de iodo.
3.5.5 Análise dos Extratos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detector de Arranjos de Diodo (CLAE-DAD)
Os extratos brutos obtidos foram submetidos a analise do perfil cromatográfico via CLAE-DAD em gradiente exploratório, sendo 1 mg do extrato solubilizado em 1 mL de metanol. As análises foram realizadas em uma coluna de fase reversa C18 com uma coluna de guarda C18. O volume de amostra injetado foi 30 µL e eluição em gradiente MeOH/H2O por 40 min., fluxo de 1,0 mL/min. e varredura de comprimento de onda de 190 - 400 nm, para posterior escolha do melhor comprimento de onda. Em algumas análises foi preciso aumentar o tempo de corrida para se ter certeza de que todos os compostos haviam sido eluídos.
Os cromatogramas e os espectros de absorção no UV dos extratos brutos foram impressos e comparados visualmente.
47 3.5.6 Análise dos Extratos por Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
Para a realização dos espectros de RMN de 1H, pesou-se 10,0 mg das amostras e diluiu-se em 0,6 mL de clorofórmio deuterado. Em seguida, as soluções foram filtradas em esfera de algodão e armazenadas em tubo de vidro próprio para RMN.