Estudos de Citotoxicidade em Culturas de Células

Uma vez que a pele é frequentemente exposta, intencionalmente ou não, a produtos cosméticos, é evidente que o risco de um determinado ingrediente/produto causar irritação ou corrosão na pele tem de ser cuidadosamente avaliado como parte do processo de avaliação global de segurança. [33]

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A utilização de modelos in vitro como ferramenta de avaliação de toxicidade foi desenvolvida durante as últimas décadas, principalmente devido à necessidade de obter melhores previsões dos efeitos potencialmente tóxicos de vários produtos químicos na saúde humana. Além disso, nos últimos anos designadamente por razões económicas e éticas tem-se assistido a uma redução da utilização de modelos animais em ensaios de toxicidade. [34]

A utilização de metodologias alternativas significa uma alteração nas guidelines oficiais sobre a realização de estudos toxicológicos para a avaliação dos efeitos potencialmente tóxicos exercidos por substâncias químicas em geral que afectam a saúde humana, incluindo os cosméticos, sendo essas substâncias parte integrante destes produtos comercializados. Em vez de animais, estes métodos alternativos utilizam culturas de células bacterianas e diferentes culturas de mamíferos ou de humanos, tecidos e órgãos particulares de animais, sistemas artificiais ou programas de análise computacional.[34]

A irritação da pele ou irritação dérmica é definida como um dano reversível da pele após a aplicação de uma substância em estudo num período que pode ir até aproximadamente 4 horas. Recentemente, foram oficialmente validados 5 testes in vitro para avaliação da irritação na pele (tabela 6). [34]

Os testes de corrosão dérmica pretendem avaliar o potencial de uma substância causar danos irreversíveis na pele, tais como necrose a nível da epiderme e derme na sequência da aplicação de uma substância em estudo num período de 3 minutos a 4 horas. Corrosividade não é uma característica que se espere que ocorra num cosmético, mas ocasionalmente essa situação pode acontecer após um erro de fabrico ou uso indevido pelo consumidor. Por outro lado, um ingrediente cosmético que tem como propriedade intrínseca ser corrosivo, pode em determinadas condições ser utilizado em cosméticos, dependendo muito da sua concentração final no produto cosmético, do pH, da presença de substâncias "neutralizantes", dos

Tabela 6. Resumo dos métodos in Vitro envolvidos no estudo da irritação da pele efectuados pela European

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excipientes utilizados, da via de exposição, das condições de utilização, etc. Os testes efectuados para avaliar a corrosão encontram-se representados na tabela 7. [34]

5.1. Fibroblastos como Modelo de Estudo in vitro

O uso de culturas de linhas celulares tem vindo a aumentar exponencialmente nas áreas de Fisiologia, Farmacologia e Toxicologia. De Facto a utilização de células em cultura tornou-se indispensável na investigação, nomeadamente em Biologia Molecular e Celular, podendo contribuir para uma diminuição do uso de animais em experimentação. Neste âmbito, os fibroblastos animais e humanos têm sido um dos tipos de células mais utilizados em diversos tipos de estudos. [35]

Takashima et. al [36] _{referem as vantagens da utilização de culturas de fibroblastos em} estudos de investigação tais como, a facilidade de obtenção de amostras de pele das várias partes do corpo através de biópsia, que constituem a principal fonte de fibroblastos, e devido a características de proliferação rápida e contínua destas células na presença de soro após o isolamento e estabelecimento de cultura. Esta linha celular comparativamente a outros tipos de células não necessita de factores de crescimento adicionais.

Efectivamente, todas as características anteriormente referidas contribuem para a atractividade de utilização destas células, contudo o principal interesse da utilização dos fibroblastos como modelo de estudo prende-se com o facto de estas células serem parte integrante da pele. [37]

Tabela 7. Resumo dos métodos alternativos validados e mais avançados para estudo de corrosão da pele. [33]

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5.2. Ensaio de Viabilidade Celular

A quantificação do efeito proliferativo e/ou citotóxico que compostos específicos podem exercer sobre as células em cultura pode ser efectuada através de diferentes métodos, incluindo os que são baseados na contagem directa de células, na medição da actividade metabólica e do conteúdo de ADN celular. [38]

Neste contexto, uma das metodologias mais utilizadas consiste na avaliação da viabilidade celular, através da redução de sais de tetrazólio, como é o caso do brometo de 3-(4,5- dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT). [39]

De facto, a determinação da viabilidade celular pelo ensaio MTT, proposta por Mosmann em 1983, é um procedimento rápido, simples, preciso e económico para avaliação da citotoxicidade e da proliferação celular in vitro. [40] _{Desde essa altura, foram introduzidas} várias modificações no procedimento, e hoje este ensaio é frequentemente utilizado em laboratórios de Biologia Celular de todo o mundo. [41]

Este ensaio consiste numa reacção colorimétrica, resultante da redução do sal amarelo de tetrazólio MTT, fundamentalmente, pelas succinato-desidrogenases presentes nas mitocôndrias das células viáveis, o que conduz à formação de um produto púrpura insolúvel em meio aquoso, designado formazano (figura 10), e que é quantificado espectrofotometricamente após solubilização por um solvente adequado. A quantidade de formazano reflecte, na maioria das populações celulares, a actividade metabólica mitocondrial, e está portanto, relacionada com número de células viáveis presentes na cultura em estudo. [42, 43]

Tratando-se de um ensaio custo-efectivo, com uma vasta aplicabilidade quer em culturas celulares primárias como em linhas celulares, a redução do MTT pelas células viáveis em cultura tem sido um dos métodos mais recomendados para o estudo do efeito citotóxico de xenobióticos, avaliação de taxas de proliferação e análise da actividade celular. [41,43]

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