Estudos de docagem molecular

Como mencionado anteriormente, um dos fatores que pode dar origem â promiscuidade catalítica em enzimas são as interações entre os resíduos de aminoácidos do sítio ativo e regiões próximas que entram em contato direto com o substrato durante a catálise. [66,68] _{Com o intuito de estudar o papel destes} aminoácidos na catálise do mecanismo SN2’ foi realizado um estudo de docagem molecular do substrato 71 e a enzima OYE1 de S. pastorianus, que tem sua estrutura tridimensional depositada no Banco de Dados de Proteínas (número 1OYB) e 91% de similaridade com OYE2. De igual modo, os resíduos do sítio catalítico das duas enzimas são conservados, tornando o estudo um bom indicador das interações que ocorrem quando 71 está posicionado no sítio catalítico de OYE2.

Estas simulações foram realizadas em colaboração com o Prof. Dr. Daniel Fabio Kawano da Faculdade de Farmácia da Unicamp e nele foram sugeridas 6 modos de ligação do composto 71 (poses) no sítio ativo de 1OYB. Na tabela 4 são apresentados os valores de escore de docagem para estas 6 poses. Estes valores foram calculados na ferramenta GoldScore,[101] _{e refletem as pontuações para cada}

pose considerando as energias de ligações de hidrogênio, energias de van der

Waals, interações com metais e tensões de torcionais do ligante (Tabela 4).

As 3 primeiras poses possuem os valores de escore mais altos, porém as distâncias mais efetivas entre o carbono  e o N5 do FMNH2 e o carbono  e o oxigênio da Tyr196 foram obtidas com as poses 4 (Figura 9A), 5 (Figura 9B) e 6 (Figura 9C).

Tabela 4. Valores de escore e distâncias entre os carbonos β em relação à carbonila de 71 e o nitrogênio N5 de FMNH2, sítio doador de hidreto, os carbonos α de 71 e o oxigênio da Tirosina196, sítio doador de próton.

Pose Escore de docagem* Distância entre Cβ e N5-FMNH2 (Å) Distância entre Cα e O-Tyr196 _(Å) 1 70,39 4,37 3,53 2 70,38 4,13 3,42 3 68,30 4,17 3,46 4 65,87 3,43 3,76 5 65,63 3,31 3,43 6 64,58 3,73 3,34

Figura 9. Modos de ligação preditos para o composto 71 no sítio ativo da OYE1 de S. pastorianus. A) Modo de ligação (pose) 4; B) Modo de ligação (pose) 5; C) Modo de ligação (pose) 6. Imagem cedida pelo Prof. Daniel Fabio Kawano.

A pose 4 (Figura 9A) corresponde ao posicionamento normal de 71 no sítio ativo da enzima. Neste modo de ligação o produto de biorredução formado seria o (S)-74, enquanto que a pose 6 (Figura 9C) corresponde ao modo de ligação flipped de 71 no sítio ativo da enzima e geraria o produto de redução (R)-74. A distância efetiva para a transferência de hidreto do FMNH2 é da ordem de 3,4 até 4,5 Å.[31] _Assim, tanto na pose 4 como a 6 são consideradas adequadas para permitir a transferência de hidreto do FMNH2 para o carbono  devido a que as distâncias entre Cβ e N5- FMNH2 é <3,7 Å. Porém, a formação preferencialmente de (R)-74 (88% ee) apontaria a que a distância mais curta entre o carbono  e o oxigênio da O-Tyr196 seria o fator determinante no favorecimento do modo de ligação flipped sobre o

normal.

Em geral, as duas poses apresentam-se semelhantes, com o anel aromático de 71 envolvido em interações do tipo empilhamento π-π com os resíduos Phe250 e Phe296 da OYE1, além de interações hidrofóbicas com o resíduo de Pro295. Outros resíduos como o Trp116 e Thr37 participam no posicionamento do substrato mediante ligações de hidrogênio (Figura 10A e 10B).

A pose 5, apresentou um resultado de grande relevância na procura de evidencias que apontem a causa do mecanismo SN2’. Nesta pose, observa-se uma ligação de hidrogênio entre o resíduo de aminoácido Tyr82 e o nitrogênio terminal do grupo azido do substrato 71. O grupo azido é considerado um forte aceptor de ligações de hidrogênio e a ocorrência desta ligação ajudaria a estabilizar o grupo azido, favorecendo assim seu caráter como grupo abandonador e consequentemente a reação SN2’ (Figura 10C).

Figura 10. A) Mecanismo proposto para a biorredução de 71 com base na pose 6, o qual resultaria na formação de (R)-74. B) Mecanismo catalítico proposto para a biorredução de 71 com base na pose 4, o qual resultaria na formação de (S)-74. C) A) Mecanismo catalítico proposto para a reação SN2’ de 71 com base na pose 5, o qual resultaria na formação de 68. Figuras cedidas pelo Prof. Dr. Daniel Fabio Kawano.

3.2.6. Estudo da biocatálise da (Z)-3-azidometil-4-fenil-3-buten-2- ona (71) com outras EREDs

Com o intuito de estudar a promiscuidade catalítica de outras EREDs frente ao substrato 71 foi usado o kit de screening de EREDs da Codexis. Este kit está disponível comercialmente e contém 7 diferentes EREDs cujas estruturas e sequências de aa são desconhecidas. As biocatálises foram realizadas nas mesmas condições que a reação com OYE2. As reações foram monitoradas no tempos 1 h e 24 h e as conversões são apresentadas na tabela 5. Do total das 7 biocatálises com as EREDs, 6 resultaram no consumo de >95% de 71 na primeira hora da reação. As EREDs 110, 112 e 207 formaram os produtos (R)-36 e 68, possivelmente através do mecanismo SN2’ de transferência de hidreto ao carbono  seguido da saída de N3-_. Interessantemente, as biocatálises com as EREDs 103, P1-A04 e P1-E01 resultaram na formação de (R)-74, (R)-36 e 68 em menor ou maior medida. Estes resultados permitem concluir que outras EREDs também podem apresentar promiscuidade catalítica em reações com o substrato 71, catalisando a formação de 68 pelo mecanismo SN2’ e (R)-74 pela adição de H+ _{e H}-_{, não sendo este um mecanismo} exclusivo de OYE2. A reação com a ERED P1-H09 apresentou baixa conversão e unicamente 53% do substrato foi consumido em 24 horas de reação. Possivelmente esta ERED tem dificuldade para acomodar o substrato no sítio ativo para realizar a catálise.

Tabela 5. Conversões de 71 nas reações biocatalíticas mediadas pelas EREDs do kit de screening da Codexisa

ERED Tempo (h) 71 (R)-74 68 (R)-36 [%]b _[%]b _%eec _[%]b _[%]b _%eec 103 1 - 58 97 7 35 87 24 - 30 nd 19 57 ** 110 1 - - - 3 97 >99 24 - - - 7 99 87 112 1 5 - - 3 91 >99 24 4 - - 4 91 86 207 1 - - - 3 97 98 24 - - - 3 97 86 P1-A04 1 - 6 nd 3 91 97 24 - 1 nd 5 94 91 P1-E01 1 - 69 >99 8 23 90 24 - 10 nd 56 34 88 P1-H09 1 68 - - 8 24 31 24 47 - - 8 44 20

a _{Reação com 0,5 mmol de 71.} b _{Conversão determinada por CG-EM.} c_%ee determinado por CG-DIC. nd = não determinado.