Estudos de Fluorescência com Brometo de Etídio

O brometo de etídio (EtBr) é um composto que conhecidamente se intercala com o DNA, apresentando uma fluorescência aumentada quando isto

ocorre 86. A intensidade de fluorescência a 606 nm de soluções contendo os

compostos e DNA em duas razões molares ([composto]/[DNA]) foi acompanhada

com crescentes concentrações de EtBr em uma solução aquosa de NaClO4

10 mmol L-1. Os resultados estão mostrados na Figura 4.45.

Pode-se observar na Figura 4.45, que a maior intensidade de fluorescência é para a solução contendo somente DNA e EtBr e a menor é para a solução contendo somente EtBr. Este comportamento é esperado já que o EtBr tem uma intensidade de fluorescência muito maior quando interage com DNA em comparação com quando não há interação.

Figura 4.45 Intensidade de fluorescência a 606 nm de soluções aquosas

de NaClO4 a 10 mmol L-1 com crescentes concentrações de EtBr. Linha sólida: razão

molar 0,1. Linha tracejada: razão molar 0,2.

Ambos os compostos estudados mostraram uma menor intensidade que a solução contendo somente DNA e EtBr e uma maior intensidade que a solução com

DNA + EtBr

DNA + EtBr + Thim

DNA + EtBr + Pd-Thim

EtBr

somente EtBr. Isto significa que há mais EtBr em solução em vez de intercalado com o DNA, quando compara-se com a solução contendo somente DNA e EtBr. O Thim apresenta uma intensidade maior que o Pd-Thim e não apresenta nenhuma diferença considerável entre as duas razões molares, indicando que o DNA já está saturado com Thim na menor razão molar.

Os resultados indicam que o ligante e o complexo de Pd(II) interagem com DNA consideravelmente. Por esta análise não se pode dizer qual é o modo de interação, sendo possível que ocorra intercalação competitiva com o EtBr ou outras formas de interação que dificultem a intercalação do EtBr com o DNA, como ligação covalente ou ligação de hidrogênio. Além disso, como o Thim apresenta a menor diferença em relação à solução de DNA e EtBr, pode-se assumir que o modo de interação do Thim com DNA é mais fraco que a interação do Pd-Thim com esta macromolécula.

Não pode-se eliminar a possibilidade dos compostos estarem diminuindo a fluorescência (quenching) do EtBr por outro mecanismo como transferência de energia, formação de complexos (Thim-EtBr e Pd-Thim-EtBr) ou quenching colisional. Uma forma possível de analisar se estas interações ocorrem seria analisando a intensidade de fluorescência de soluções contendo somente Thim e EtBr e Pd-Thim e EtBr. Assim, não pode-se afirmar com certeza utilizando somente esta técnica que estes compostos interagem com o DNA ou avaliar o seu modo de interação.

4.6.3 Dicroísmo Circular

Os espectros de dicroísmo circular (DC) do Thim e do Pd-Thim são apresentados na Figura 4.47 mostrando crescentes razões molares do composto frente ao DNA. Esta técnica visa analisar a interação da luz circularmente polarizada com a matéria. O DNA é uma macromolécula quiral, portanto este interage com a luz polarizada mudando sua direção. O DC é muito utilizado para a análise conformacional de biomoléculas, sendo que cada conformação diferente do DNA ou

de outras biomoléculas apresenta um espectro diferente 89,90. Como exemplo na

Figura 4.46 são mostradas as principais conformações do DNA, sendo a forma B a mais comum.

(b)

(a)

Figura 4.46 Diferentes conformações do DNA, (a) visão lateral e (b) visão superior.

Adaptado de Lu et al. 91. Cada conformação possui um perfil distinto no espectro de

dicroísmo circular.

O espectro de DC do CT-DNA na sua forma B apresenta uma banda negativa em 245 nm devido à helicidade right-handed e uma banda positiva em

275 nm relacionada com o stacking entre as bases 90,92. Quando moléculas

pequenas se ligam ao DNA por ligação aos sulcos (groove) ou interações eletrostáticas grandes distorções no espectro de DC são observadas, enquanto que a intercalação causa a estabilização da forma B do DNA, portanto aumentando as

intensidades das bandas relacionadas com a helicidade e o stacking 93,94.

Na Figura 4.47 (a), referente à interação de Thim com o DNA, pode-se observar que não houve alterações significativas no espectro de DC do DNA com a adição de crescentes concentrações do ligante. O perfil do espectro continua o mesmo, o que pode ser explicado de duas maneiras: ou o ligante não interage com o DNA ou a forma de interação não causa distorções conformacionais no DNA. Como não houve aumento significativo das bandas observadas pode-se confirmar que, caso haja interação, esta não é por intercalação.

Figura 4.47 Espectros de DC do CT-DNA puro e com crescentes concentrações de (a) Thim e (b) Pd-Thim.

Na Figura 4.47 (b) estão apresentados os dados do Pd-Thim com o DNA. Pode-se observar neste caso uma alteração significativa no perfil do espectro quando comparado ao espectro do DNA puro. A banda em 220 nm apresenta uma diminuição de intensidade significativa, além de deslocamento batocrômico. A banda

(b)

(a)

´

do CT-DNA em 245 nm também apresenta diminuição de intensidade com o aumento da concentração de complexo, o que indica que o Pd-Thim perturba a helicidade do DNA e que não ocorre intercalação.

Observa-se também dois pontos isodicroicos (ponto onde as curvas se cruzam), um em 233 nm e outro em 258 nm. Pontos isodicroicos são indícios de que

há a presença de mais de uma espécie em solução. Segundo Macquet e Butour 89 o

aparecimento de um ponto isodicroico em 233 nm é observado quando complexos de Pt(II) se ligam ao DNA, cuja forma de interação é pela formação de ligações covalentes com as nucleobases. Portanto, esta análise mostra que o Pd-Thim interage com o DNA e sugere que a forma de interação é pela formação de ligações covalentes.

4.6.4 Determinação do Ponto de Desnaturação Térmica do DNA

Curvas de desnaturação do DNA estão apresentadas na Figura 4.48. O ponto de desnaturação térmica (Td) foi determinado como a temperatura em que a

segunda derivada da curva obtida é zero, no intervalo 60-80 ºC (ponto de inflexão da

curva sigmoidal). Os valores de Td obtidos estão na Tabela 4.18.

O ponto de desnaturação térmica do DNA é definido como a temperatura

em que metade dos pares de nucleobases não está pareada 95. É a temperatura de

meia transição entre as formas dupla fita e simples fita do DNA 96, como mostrado na Figura 4.49. Este experimento é comumente empregado para estudar interações

de pequenas moléculas com o DNA, já que um aumento ou diminuição da Td indica

uma ligação preferencial à forma dupla ou simples fita, respectivamente 96. Quando

Figura 4.48 Curvas de desnaturação témica do DNA, DNA e Thim e DNA e Pd-

Thim. [DNA] = 100 μmol L-1_{, [composto] = 10 μmol L}-1

. Somente uma replicata de cada amostra é mostrada e as curvas tiveram sua absorbância normalizada para

melhor visualização.

Figura 4.49 Processo de desnaturação do DNA. O ponto de desnaturação térmica

Tabela 4.18 Pontos de desnaturação do DNA (oC) para o DNA livre e em presença do ligante Thim e do complexo Pd-Thim.

Compostos Resultados Δ (composto – DNA)