Estudos em Biossensor de dsDNA

A ativação de fármacos através de biorredução é uma modalidade farmacoterapêutica visando à morte de células com limitada concentração de oxigênio (células hipóxicas). Nesse sentido, compostos nitroaromáticos, como o nitroimidazóis e nitrofuranos, são fármacos biorredutíveis com inúmeras aplicações em química medicinal. A redução do grupo nitro é o mecanismo chave desta atividade, sendo a ciclagem redox outro caminho pelo qual nitroaromáticos exercem sua atividade (Colón et al., 2008). Inúmeras atividades biológicas também são observadas para os compostos quinoídicos. Quinonas como as antraciclinas, daunorrubicina, doxorrubicina, entre outras, são muito utilizadas clinicamente para o tratamento de várias linhagens de câncer (Valderrama et al., 2008).

A atividade farmacológica de quinonas é decorrente da inibição de enzimas importantes ao DNA, como as topoisomerases, ou através de intercalação a este, e, ciclagem redox com oxigênio após processo de biorredução como mencionado. Assim, é esperado para compostos detentores destas duas funcionalidades famacofóricas (quinona e nitroaromático), com propriedades eletrofílicas e oxidantes, apresentem reatividade frente ao DNA. Desta forma, uma vez confirmada a geração de estresse reativo por parte dos produtos de reação da nor--lapachona e seus derivados nitroquinonas, a reatividade frente à biomolécula do DNA foi investigada.

Os estudos dos compostos 1, 2 e 3 com o DNA foram realizados, utilizando um filme espesso de dsDNA, preparado pela solubilização do DNA dupla fita em tampão acetato, pH 4,5, depositado sobre superfície de um eletrodo de carbono vítreo - um biossensor de dsDNA. Este biossensor foi imerso em solução de cada composto e, transcorrido o tempo de contato estabelecido, efetuaram-se as medidas eletroquímicas, para averiguar possíveis modificações no perfil eletroquímico do DNA.

Em estudos descritos na literatura (Brett et al., 1999; De-los-Santos-Álvarez et al.,2004), a oxidação eletroquímica do DNA em meio ácido, pH 4,5, refere-se às bases guanina e adenina. Como as bases do DNA dupla fita (dsDNA) efetuam ligação de hidrogênio, as intensidades das correntes de pico de oxidação são inferiores àquelas observadas em estudo realizado com o DNA fita simples, desnaturado em meio ácido. Quando o biossensor de dsDNA é estudado em

presença de um fármaco que tem como alvo biológico de ação o DNA, observa-se um aumento nas intensidades das correntes de oxidação, caracterizando interação positiva, devido à exposição das bases (guanina e adenina) a processo redox em superfície eletródica. Estudos da interação de quinonas e nitroaromáticos, de maneira direta ou após processo redox (redução/oxidação) são relatados na literatura (Vyskocil et al., 2010).

A seguir, são descritos os resultados referentes aos estudos de 1, 2 e 3, em biossensor eletroquímico de dsDNA. Para o composto padrão, nor--lapachona, em ensaios prévios, não houve evidência de interação, um comportamento análogo ao observado para a -lapachona (Brett et al,. 2002).

Os estudos por voltametria de pulso diferencial do dsDNA, em presença do composto 1 são representados na Figura 67a-b, realizados seguindo duas metodologias. Na primeira, o biossensor de dsDNA foi imerso em solução de 1 e, transcorrido um tempo de contato de 15 minutos, medidas eletroquímicas foram realizadas, Figura 67a. O segundo método consistiu na aplicação de potencial de redução correspondente à redução dos grupos eletroativos, sendo borbulhado na cela eletroquímica, argônio, para eliminar a interferência de oxigênio e, logo em seguida, a varredura em potencial anódico foi realizada, Figura 67b.

A interação de 1 com dsDNA é evidenciada tanto diretamente, quando o biossensor de dsDNA é imerso em solução do mesmo, quanto após uma pré- eletrólise para redução deste, realizada na matriz de DNA. O voltamograma de pulso diferencial da Figura 67a (vermelho), para o biossensor em presença de 1 apresenta dois picos de oxidação (Epa1 = +1,06 V e Epa2 = +1,31 V). O primeiro pico apresenta-

se alargado e, em analogia ao estudo de 1, em eletrodo de carbono vítreo, da Figura 67a (azul), deve ser relativo a dois processos redox, a oxidação do grupo amino e oxidação de base do guanosina. Considerando o voltamograma apenas do biossensor, Figura 67a (preto), que apresentou sinais de oxidação, o pico observado em potencial mais anódico (+ 1,31 V) está relacionado à oxidação da guanosina.

Figura 67. a: VPD do biossensor de dsDNA, em ausência (●) e presença de 1 (●). VPD de

1, em eletrodo de carbono vítreo (●). b: VPD do biossensor de dsDNA, em ausência de 1 (●)

e presença de 1 (●). VPD de 1 em eletrodo de carbono vítreo (●) (Eap = - 0,8 V). Todas a

análises foram realizadas em meio aquoso etanólico (10%), tampão acetato (0,1 mol L-1_{) pH}

4,5, C = 0,05 mmol L-1_{. Eletrodo de carbono vítreo, = 5 mV s}-1_.

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 0,5 2,0 3,5 5,0 + 1,31 V adenosina + 1,06 V guanosina C o rr e n te /  E / V vs Ag|AgCl|Cl- 0.1 mol L-1 dsDNA dsDNA + 1 (0,05 mmol L-1 ) CV - 1 (0,05 mmol L-1 ) a + 1,01 V 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1 2 3 4 5 + 0,62 V Azoxi + 0,35 V 8-oxo-guanina + 0,05 V hidroxilamina + 1,07 V + 1,31 V adenosina C o rr e n te /  E / V vs Ag|AgCl|Cl- 0.1 mol L-1 dsDNA dsDNA + 1 (0,05 mmol L-1) CV - 1 (0,05 mmol L-1) b + 1,07 V guanosina + 1 Fonte: Autor, 2011.

Os estudos realizados com aplicação de potencial de redução (Eap. = -0,80 V)

evidenciaram que os produtos da eletrorredução 1 são DNA-reativos, Figura 67b. Em eletrodo de carbono vítreo, Figura 67b (azul), após aplicação de potencial de redução, três picos de oxidação são observados. O primeiro destes, em + 0,05 V, está relacionado à formação do derivado nitroso pela oxidação da hidroxilamina, gerada a partir do potencial aplicado. Já o segundo pico de oxidação, em +0,62 V, refere-se à oxidação do azoxi derivado, formado pela condensação dos produtos de redução do grupo nitro, o intermediário nitroso e hidroxilamina (Lund, 2001). O terceiro potencial de oxidação (+ 1,07 V) corresponde à oxidação do grupo amino aromático, como já discutido anteriormente. Quando o mesmo tratamento foi aplicado ao biossensor de dsDNA em presença de 1 (Figura 67b, vermelho), foram observados os picos referentes aos derivados nitroso e azoxi, contudo, o pico de oxidação do grupo amino em +1,07 V, apresentou-se mais alargado e de maior intensidade de corrente, caracterizando a presença de um processo redox adicional.

Nesse estudo, Figura 67b, o dano ao DNA foi verificado pela presença de três ondas de oxidação, duas relacionadas à guanosina (+1,07 V) e adenosina (+1,31 V) e, uma onda anterior (Epa1 = +0,35 V) que, em comparação com estudos realizados

biossensor de dsDNA, está relacionado à 8-oxoguanina, produto da oxidação da guanina pelo intermediários de redução da nitroquinona.

Os estudos realizados em biossensor de dsDNA para 2 apresentaram interação positiva frente ao DNA. Nesse caso, foram realizados estudos em baixas concentrações, pois o mesmo se apresentou mais insolúvel que as nitroquinonas 1 e