Estudos estruturais do complexo PrTX-I/AR por cristalografia de raios X

Os primeiros cristais do complexo formado entra a toxina PrTX-I e seu inibidor ácido rosmarínico (AR) (Figura 7a, b) foram obtidos dois meses após a montagem dos experimentos, numa condição de cristalização diferente da que é possível obter cristais da proteína PrTX-I na forma nativa. A otimização da condição nos levou aos melhores cristais quando utilizamos gotas de 1Pl de solução protéica, 0,5 Pl de solução contendo AR (35mM) e 1Pl de solução mãe (20% PEG4000, 0,1M citrato de sódio pH 5.6 e 20% 2-propanol). Os melhores cristais obtidos foram levados para coleta de dados na linha MX-2 da LNLS, em Campinas / SP e difrataram a 2,3 Å. Após o processamento dos dados, não foi possível identificar nenhuma densidade eletrônica que pudesse corresponder à molécula de AR durante a fase de refinamento. Três pontos foram então considerados: i) quantidade insuficiente do inibidor na solução de cristalização (inicialmente esta foi calculada em cinco moléculas de inibidor para cada molécula de proteína), ii) baixa resolução dos dados obtidos (considerando que o ligante pode ainda apresentar baixa ocupação), e iii) problemas de solubilidade do AR. Por esses motivos, tentativas de melhorar os cristais para aumentar a qualidade dos mesmos, bem como testes para melhorar a solubilidade do AR e aumentar a proporção do inibidor em relação à da proteína foram realizados. Uma nova busca inicial para obter uma possível diferente condição de cristalização também foi realizada, porém sem sucesso.

Nos novos experimentos realizados, a proporção de moléculas inibidor / proteína na gota foi aumentada e uma varredura por diferentes pHs em que os primeiros cristais do complexo foram obtidos foram testados. Após alguns meses, conseguimos cristais maiores (0,6 x 0,1 x 0,05 mm) (Figura 7c) e que difrataram à maior resolução (1,77 Å). As estatísticas da coleta de dados são apresentadas na Tabela I. Os cristais pertencem a grupo espacial P212121, com parâmetros de cela unitária a=49,4, b=67,0 and c=85,5 Å. O conjunto de dados apresenta completeza de 95,1 % e Rmerge de 6,8 %. Cálculos baseados no peso molecular da proteína indicaram a presença de duas moléculas na unidade assimétrica (Matthews, 1968).

Figura 7. Cristais da proteína PrTX-I na presença do inibidor ácido rosmarínico (AR). (a) e (b) Policristais do complexo PrTX-I/AR. (c) Monocristal do complexo PrTX-I/AR obtido após otimização da condição de cristalização em que os cristais representados em (a) e (b) foram obtidos.

Após refinamento parcial da estrutura, observamos densidade eletrônica compatível com a do ligante em estudo na entrada de um dos canais hidrofóbicos da toxina (Figura 8). A inspeção da densidade eletrônica no mapa 2ۄ)obsۄ-ۄ)calcۄ também mostrou a presença de uma molécula de PEG4000 e oito moléculas de isopropanol (IOH) interagindo com a toxina.

Figura 8. Mapa de densidade eletrônica 2|Fobs|-|Fc| (corte de 1V) mostrando a região de entrada

do canal hidrofóbico onde pode-se observar densidade eletrônica compatível com a de uma molécula de ácido rosmarínico nas proximidades dos aminoácidos Lys7 e Lys122. Figura retirada do artigo de dos Santos e colaboradores (Dos Santos et al., 2010).

Tabela I. Estatísticas de coleta de dados de difração de raios X e de refinamento para a estrutura do complexo PrTX-I/AR. PrTX-I/AR Cela unitária (Å) a = 49,4 b = 67,0 c = 85,5 Grupo especial P21212 Resolução (Å) 1 40,0-1,77 (1,86-1,77) Reflexões únicas a 26992 (3895) Dados completos a (%) a 95,1 (97,5) Redundância a 4,0 (3,3) R a mergeb(%) 6,8 (41,2) Fonte de radiação a Síncrotron (linha MX2, LNLS)

Temperatura da coleta de dados (K) 100

I/ı(I) 16,5 (2,0)

Coeficiente de MatthewsV

a

M(Å3/Dalton) 2,62

Moléculas na unidade assimétrica 2

Conteúdo de solvente (%) 53,12 Rcristc(%) 16,0 Rfreed(%) 21,7 B-factor médio (Å2)e Total 37,2 Proteína 22,7 AR 44,2 Gráfico de Ramachandran e

resíduos em regiões mais favoráveis (%) 89,9

resísduos em regiões adicionalmente permitidas (%) 9,1 resíduos em regiões generosamente permitidas (%) 1,0

a _{Números em parênteses são para a faixa de mais alta resolução.} b_R

merge =6hkl(6i(|Ihkl,i-<Ihkl >|))/6hkl,i

<Ihkl>, onde Ihkl,ié a intensidade de uma medida individual de uma reflexão com índices de Miller h, k e

l, e <Ihkl> é a intensidade média daquela reflexão. Calculado para I > -3V (I).c Rcrist = Rhkl(||Fobshkl| -

|Fcalchkl||)/|Fobshkl|, onde |Fobshkl| e |Fcalchkl| são as amplitudes dos fatores de estrutura observados e

calculados. dRfreeé equivalente ao Rcrist, porém calculado com 5% das reflexões omitidas no processo de

O modelo cristalográfico foi concluído e o mesmo apresentou R = 16,0 e Rfree = 21,7% (Tabela I). Uma análise das interações estabelecidas pelo inibidor com a proteína mostra que o AR interage com a PrTX-I por meio de ligações de hidrogênio com os resíduos Phe3, Lys7, Leu10, Gln11 and Gly15 do monômero A (Figura 9) e com os resíduos Leu2, Arg72 e Trp77 deste mesmo monômero via molécula de água. Ainda, interações entre o AR e o resíduo Pro123 do monômero B são observadas (Figura 9), causando uma obstrução física da entrada do canal hidrofóbico do monômero A. Já o canal hidrofóbico do monômero B é ocupado por uma molécula de PEG4000, a qual estabelece contatos com a Phe3 e Lys7 do monômero B, sendo que a última ocorre também via uma molécula de água. Duas das oito moléculas de isopropanol (IOH) interagem com resíduos de His48 (átomos NG1) da estrutura dimérica através da molécula de água que faz parte do sítio ativo de PLA2

Os resíduos K36A, K78A, L116A e K129A no monômero A, e K70A, L116A e K127A no monômero B foram modelados como alaninas devido à falta de densidade eletrônica para as cadeias laterais dos resíduos em questão. Ainda, as cadeias laterais dos resíduos K38 e K69 do monômero A e E86, K93 e K122 do monômero B foram modeladas com configurações alternativas. A análise da qualidade do modelo demonstra que o mesmo apresenta uma boa estereoquímica, já que somente 1% dos resíduos se encontra em regiões menos favoráveis no gráfico de Ramachandran (Tabela I).

s catalíticas (Scott et al., 1990). Ligações de hidrogênio também são observadas entre os resíduos Asn17:Tyr119 e Tyr119:Tyr119 dos monômeros que compõe a estrutura.

A comparação da estrutura do complexo PrTX-I/AR com a estrutura da proteína PrTX-I nativa (Dos Santos, Soares et al., 2009) (PDB ID 2Q2J) mostrou um rearranjo entre seus monômeros induzido pela presença do ligante (Figura 10). Este rearranjo afetou principalmente o C-terminal de um de seus monômeros (r.m.s.d. geral de 1,04 and 0,59 Å para os monômeros A e B, respectivamente, e 2,65 e 0,58 Å para os respectivos C-terminais) (Figura 10). Este rearranjo pode ser caracterizado pelo estabelecimento da ligação de hidrogênio entre os resíduos de Tyr119 dos diferentes monômeros (Tyr 119-Tyr119) e é uma característica presente em todas as estruturas de Lys49-PLA2s complexadas resolvidas até o presente momento (Dos Santos, Fernandes et al., 2009; Dos Santos, Soares et al., 2009; Marchi-Salvador et al., 2009; Fernandes et al., 2011).

Figura 9. Interações entre a PrTX-I e seu inibidor ácido rosmarínico (AR). Resíduos cujos contatos se dão via moléculas de água não são demonstrados. Somente interações abaixo de 3,7Å são mostradas para interações ente o AR e o monômero A da proteína. Distâncias até 4,0 Å foram consideradas para interações entre o AR e o monômero B. O mapa de densidade eletrôncia para a molécula de AR foi calculado com coeficientess 2¨Fobs¨-¨Fcalc¨ e contornados a

1.0V. Figura gerada no programa Pymol (Delano, 2002).

Figura 10. Sobreposição entre a PrTX-I nativa e PrTX-I/AR: (a) representação em forma de ribbons para os dímeros de ambas as estruturas; (b) sobreposição entre os monômeros correspondentes de ambas as estruturas. R.m.s.d. para o monômero todo e para o C-terminal (resíduos 115-129) é mostrado. O maior r.m.s.d. para o monômero B se deve a mudanças conformacionais induzidas na região C-terminal da PrTX-I após interação com o ligante AR. Figura gerada no programa Pymol (Delano, 2002).

Em 2009, uma revisão de todas as estruturas de Lys49-PLA2

A estrutura cristalográfica do complexo PrTX-I/AR evidencia que o inibidor interage com a toxina na entrada do seu canal hidrofóbico (Figura 11b). Considerando o recente e acima citado mecanismo de ação proposto para as Lys49-PLA

s disponíveis no banco de dados PDB, tanto nas formas nativas quanto complexadas, serviu de base para a proposição do sítio miotóxico destas proteínas (resíduos responsáveis pela atividade desestabilizadora de membranas musculares) bem como seu mecanismo de ação (Dos Santos, Soares et al., 2009). A proposta sugere um mecanismo de ação baseado em dois passos: num primeiro momento, ocorre a interação dos resíduos Lys20, Lys115 e Arg118 destas proteínas com a cabeça polar dos fosfolipídios de membrana e, posteriormente, ocorre um rearranjo na estrutura quaternária que possibilita a entrada de porções hidrofóbicas dos fosfolipídios no canal hidrofóbico da toxina (Dos Santos, Soares et al., 2009). Desta forma, foi sugerido o envolvimento do canal hidrofóbico destas proteínas como parte do processo de miotoxicidade e a conservação dos resíduos que o compõe ficou então justificada (Dos Santos, Fernandes et al., 2009; Dos Santos, Soares et al., 2009).

2s (Dos Santos, Soares et al., 2009), sugere-se que o efeito inibitório do AR seja resultado de um impedimento estérico já que o mesmo bloqueia o acesso do substrato ao canal hidrofóbico da toxina, o qual é uma extensão do sítio miotóxico das Lys49-PLA2

Interessantemente é possível observar que além do AR obstruir a entrada de um dos canais hidrofóbicos da PrTX-I, ele está diretamente relacionado com o C-terminal do outro monômero da toxina (Figura 11d). Esta observação demonstra como o arranjo quaternário (disposição dos monômeros entre si) das Lys49-PLA

s (Figura 12).

2

A comparação da estrutura do complexo PrTX-I/AR com duas outras estruturas de Lys49-PLA

s botrópicas contribui para sua função (ex. porções hidrofóbicas dos fosfolipídios de membrana que se inserem no canal hidrofóbico de um monômero da toxina foram provavelmente “capturados / ancorados” pelo C-terminal do monômero oposto).

2s complexadas com ácidos graxos (PDB ID 1QLL e 1XXS) (Lee et al., 2001; Watanabe et al., 2005) suporta a hipótese acima mencionada já que nesta

comparação fica evidente que o AR pode bloquear a entrada de ácidos graxos no canal hidrofóbico de Lys49-PLA2s por obstruir fisicamente a entrada deste canal (Figura 11c).

Figura 11. Estudos estruturais comparativos entre a PrTX-I/AR e duas outras estruturas de Lys49-PLA2s complexadas com ácidos graxos. (a) Representação dimérica do complexo PrTX-

I/AR em forma de cartoon; a molécula de AR é representada em sticks. (b) Representação dimérica do complexo PrTX-I/AR, onde os monômeros são representados na forma de superfície; o monômero B é representado com superfície semi-tranparente e o AR, em sticks. (c) Sobreposição dos monômeros A dos complexos PrTX-I/AR, PrTX-II/ácido graxo (em azul) e MjTX-II/ácido graxo (em rosa), mostrando que os ácidos graxos ocupam o canal hidrofóbico da proteína, região cuja entrada é ocupada pelo AR. (d) Representaçao em superfície do complexo PrTX-I/AR onde fica evidente que o canal hidrofóbico do monômero A da estrutura está intimamente relacionado com a região C-terminal do monômero B. Para as representações em superfície, o canal hidrofóbico dos monômeros são mostrados em amarelo e os resíduos 119 a 125 do C-terminal do monômero B da proteína (resíduos 119-125) são mostrados em azul. Figura gerada no programa Pymol (Delano, 2002).

Figura 12. Modelo de inibição de Lys49-PLA2s botrópicas pelo ácido rosmarínico (AR). O AR

interage com resíduos específicos da toxina (Figura 9), ocupando a entrada do canal hidrofóbico de um de seus monômeros, conforme representado na Figura 11b. Nesta configuração, embora a toxina possa interagir com a membrana por meio da região C-terminal (em azul; passo 2), seu canal hidrofóbico não pode ser ocupado por porções hidrofóbicas de fosfolipídios da membrana já que o AR obstrui fisicamente sua entrada.

Durante o andamento deste trabalho, uma colaboração foi estabelecida com o Laboratório de Farmacologia da Junção Neuromuscular, chefiado pela profa. Dra. Márcia Gallacci, do Depto. de Farmacologia, da UNESP / Botucatu. O efeito in vitro do AR nas atividades de lesão muscular e de bloqueio neuromuscular causado pela PrTX-I foi avaliado em preparações nervo frênico - músculo diafragma neste laboratório durante o trabalho de mestrado do aluno Fábio Florença Cardoso. Os resultados obtidos demonstraram que o AR é capaz de prevenir aproximadamente 80% das lesões musculares e em torno de 90% o bloqueio neuromuscular causado pela toxina (artigo submetido; Anexo II). Desta forma, concluímos que a presença de inibidores que interagem com as Lys49-PLA2s em locais diferentes do sítio miotóxico (região C- terminal) também são capazes de afetar a atividade destas toxinas. Assim, baseando-se no mecanismo de ação de Lys49-PLA2s (Dos Santos, Soares et al., 2009), é possível inferir maneiras diferentes e provavelmente simultâneas de inibir estas proteínas: i) por inibição da região C-terminal, diretamente do sítio miotóxico (ex. heparina) (Lomonte, Tarkowski et al., 1994), e ii) por inibição física do canal hidrofóbico (ex. PEG400) (Murakami et al., 2007) ou prevenção da sua ocupação (ex. AR). A combinação de todas estas possibilidades pode levar ao sucesso na inibição de Lys49-PLA2s

botrópicas. Este conhecimento também pode servir como base para o desenho de compostos adjuvantes que complementem a soroterapia.

O artigo referente à cristalização deste complexo foi publicado no periódico

Acta Crystallographica – Section F, em 2010: “Crystallization and preliminary X-ray

crystallographic studies of a Lys49-phosplipase A2 homologue from Bothrops pirajai venom complexed with rosmarinic acid” (Anexo I). Recentemente, a redação do artigo referente à estrutura do complexo, juntamente com os dados funcionais obtidos no laboratório da profa. Márcia Gallacci, foi concluída e o mesmo está em fase de submissão (Anexo II).

4.1.1. Dificuldades encontradas para a obtenção da estrutura do complexo

Durante o trabalho com o complexo mencionado, alguns conjuntos de dados foram coletados e refinados. No entanto, em alguns deles não obtivemos sucesso na identificação de densidades eletrônicas para o AR, apesar da mudança de grupo espacial em relação à proteína nativa (P212121 x P3121) estar sempre presente. A resolução do problema só foi possível quando o AR comercial foi dissolvido em solução contendo 50% de etanol.