Apesar do conhecimento dos defeitos genéticos primários das distrofias musculares, a patologia molecular que leva a degeneração muscular ainda necessita de maiores estudos. A análise em larga escala da expressão gênica permite acessar as vias moleculares que estejam alteradas no músculo distrófico. Neste sentido, o uso de microarranjos de DNA oferece uma ferramenta poderosa para a análise global da expressão gênica (Haslett e Kunkel, 2002). Com os avanços nas áreas da genômica e da proteômica, o desenvolvimento das abordagens terapêuticas está sendo cada vez mais baseado na compreensão da sinalização celular para se identificar alvos moleculares ligados à fisiopatologia. Estudar as vias de sinalização que possam estar perturbadas devido à falta de distrofina ou outros componentes do complexo pode ajudar a revelar prováveis pontos de intervenção terapêutica ou a identificação de biomarcadores da doença.
Microarranjos de DNA são lâminas formadas por micropontos de ácidos nucleicos ordenados e de alta densidade, cuja tecnologia permite a análise de expressão gênica simultânea e em larga escala, e tem sido empregada extensivamente no estudo molecular de patologias. Esta ferramenta possibilita uma compreensão global das diversas vias gênicas envolvidas tanto em doenças multigênicas como em doenças mendelianas, complementando os estudos clínicos e histológicos.
Os trabalhos publicados diferem em escala e na abordagem experimental e analítica, mas são concordantes na conclusão de que as vias moleculares encontradas refletem as características patológicas vistas na histologia. De modo geral, em todos os trabalhos, a maioria dos genes superexpressos é composta por genes ligados à resposta imune e à formação de matriz extracelular, o que condiz e corrobora os achados histológicos. O perfil de expressão gênica global, por microarranjo e outras técnicas, já foi estudado em pacientes com DMD (Chen et al., 2000; Bakay et al., 2002; Haslett et al., 2002; Goetsch et al., 2003; Haslett et al., 2003; Noguchi et al., 2003), e em camundongos
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2002; Tseng et al., 2002; Porter, Merriam, Khanna, et al., 2003; Porter, Merriam, Leahy, et al., 2003; Porter et al., 2004; Turk et al., 2005; Baban e Davies, 2008; Marotta et al., 2009).
Alguns estudos anteriores ao uso da análise de genes diferencialmente expressos por microarranjos moleculares, já sugeriam resultados muito interessantes. Tkatchenko e colaboradores analisaram a expressão gênica nos músculos posteriores e do diafragma do camundongo Dmdmdx. Foram identificados 93 genes diferencialmente expressos entre o
animal normal e o afetado. Os genes foram divididos em grupos, de acordo com a função descrita: metabolismo energético, crescimento (H19 e Igf2), diferenciação celular (NF-κB), homeostase de cálcio (Ryr1), degradação proteica, organização celular, biogênese, matriz extracelular (genes dos colágenos I, III e V), inflamação, ativação de macrófagos e genes desconhecidos. A expressão diferencial desses genes tem correlação com diversas observações já feitas nos camundongos, como a elevação do nível de cálcio intracelular e a formação de fibrose.
Dentre esses genes, destacou-se um grupo de genes codificando enzimas envolvidas no metabolismo energético, proliferação e diferenciação celular, e equilíbrio de cálcio cuja expressão foi claramente diferente entre o diafragma e os músculos posteriores do Dmdmdx, indicando que esses aspectos da função muscular possam estar comprometidos no diafragma do Dmdmdx (Tkatchenko et al., 2000).
Posteriormente, estes mesmos autores identificaram sete genes com expressão alterada em pacientes com DMD com um arranjo de cDNA: a proteína sarcomérica titina, dois genes mitocondriais, um fator de transcrição muscular e três genes ainda desconhecidos. A superexpressão dos genes mitocondriais foi associada à redução na atividade de enzimas mitocondriais observada em pacientes com DMD, o que significaria uma tentativa de compensação para manter o equilíbrio das proteínas mitocondriais. A hipoexpressão do gene da titina está relacionada com a desorganização do sarcômero e a fragilidade das miofibras desses pacientes (Tkatchenko et al., 2001).
Em outro trabalho realizado por Chen e colaboradores foi encontrada, no músculo de pacientes com deficiência de distrofina e α-sarcoglicana, alta expressão de genes do desenvolvimento, o que poderia ser atribuído ao processo de regeneração, mas a expressão desses genes não estava limitada às fibras em regeneração, indicando uma diferenciação incompleta. A hipoexpressão de genes da função mitocondrial e metabolismo energético apontam para uma crise metabólica generalizada e disfunção mitocondrial, provavelmente devido ao influxo constante de cálcio (Chen et al., 2000).
Porter et al. (2002) identificaram 242 genes expressos diferencialmente nos músculos gastrocnêmio e soleus de camundongos Dmdmdx com oito semanas de idade.
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distrofia muscular: inflamação (30% dos genes), deposição de matriz extracelular (9%), proteólise (7%), regeneração muscular (7%) e metabolismo energético (2%). A superexpressão de 22 genes de matriz extracelular contrasta com o grau limitado de fibrose no animal Dmdmdx, sugerindo a existência de algum mecanismo pós-transcricional compensador ou protetor nesses animais. O fato de 30% dos genes diferencialmente expressos serem implicados na resposta inflamatória indica uma reação inflamatória persistente no músculo do Dmdmdx (Porter et al., 2002).
Com o chip HG-U95Av2 da Affymetrix, foi confirmada a expressão diferencial de 42 genes do trabalho de Chen et al. (2000), e ainda foram identificados 63 genes não reportados previamente no músculo de pacientes com DMD. Como nos trabalhos anteriores, foi visto que há mais genes hiperexpressos em relação aos hipoexpressos, o que é atribuído ao aumento da renovação proteica e também a expressão contínua de genes de desenvolvimento muscular, devido ao processo de regeneração. Mais uma vez, genes relacionados com a resposta imune e a matriz extracelular apresentaram superexpressão, refletindo as características histopatológicas (infiltração de células inflamatórias e fibrose) dos músculos dos pacientes estudados (Haslett et al., 2002).
Para complementar e expandir os dados obtidos no trabalho anterior, os mesmos autores estudaram o perfil de expressão gênica de pacientes com DMD utilizando outro conjunto de microarranjos com maior cobertura do genoma. Foram encontrados mais 51 genes e 124 ESTs diferencialmente expressos, confirmando o padrão de expressão encontrado anteriormente. Dos 144 genes identificados como diferencialmente expressos nos dois estudos, 46 são genes que codificam proteínas envolvidas em sinalização. Isso sugere que vias de sinalização estão alteradas no músculo dos pacientes DMD, reforçando o papel sinalizador do complexo DGA (Haslett et al., 2003).
A análise do perfil de expressão global dos músculos dos membros posteriores de camundongos Dmdmdx com 13 e 15 semanas de idade (fase de estabilização da regeneração muscular), usando os microarranjos U74Av2 da Affymetrix, revelou apenas 58 genes diferencialmente expressos (Boer et al., 2002), em contraste com os 242 genes diferencialmente expressos na idade de oito semanas. Essa diferença se deve, provavelmente, ao fato de a fase mais ativa de regeneração já ter passado nos animais mais velhos. A maioria desses genes está implicada na regeneração muscular, resposta imune e proteólise. Entretanto, a inflamação, nessas idades, não é tão pronunciada quanto em animais mais jovens, como encontrado em Porter et al. (2002). Uma crise metabólica generalizada, como reportado para pacientes com DMD (Chen et al., 2000), está ausente nesses animais.
O diafragma dos animais Dmdmdx apresenta um processo de degeneração mais
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diafragma do camundongo Dmdmdx é mais semelhante histologicamente, em termos de degeneração muscular, ao músculo esquelético dos pacientes DMD.
Assim sendo, Rouger et al. (2002) estudaram a expressão gênica de camundongos controle e Dmdmdx em 12 idades diferentes, comparando os músculos posteriores e o diafragma, usando um microarranjo de cDNA personalizado. Dentre os 1082 genes estudados, 112 apresentaram expressão diferencial e foram divididos em grupos funcionais: 10 de defesa celular; 17 de sinalização; 19 de estrutura e mobilidade celular; 16 de expressão gênica/proteica; 19 de metabolismo; os 20 genes restantes não se encaixam em nenhuma categoria ou eram desconhecidos. Comparando os genes encontrados no Dmdmdx com os genes encontrados no transcriptoma de pacientes DMD, os autores concluem que a deficiência de distrofina inicia cascatas patológicas semelhantes nas duas espécies, apesar de terem encontrado muitas diferenças entre os perfis de expressão de humanos e camundongos. Com isso, os autores concluem que nenhum desses músculos do camundongo corresponde inteiramente à patologia nos humanos (Rouger et al., 2002).
Confrontando a expressão dos músculos dos membros posteriores e o diafragma, 34 genes apresentaram diferenças, com destaque para genes envolvidos na estrutura/organização de miofibras e no metabolismo energético e função mitocondrial, que podem ser os principais responsáveis pelas diferenças histológicas observadas. Portanto, a deficiência de distrofina causa perturbações diferentes nos transcriptomas desses músculos (Rouger et al., 2002).
A análise do perfil de expressão gênica do músculo gastrocnêmio de camundongos
Dmdmdx com 16 semanas de idade (fase de estabilização da regeneração) revelou 137 genes diferencialmente expressos. Essa lista de genes foi comparada com dados obtidos em humanos (Chen et al., 2000) e foi observado que há superexpressão de genes reguladores da polimerização da actina, cujos filamentos são comprometidos na ausência de distrofina, apenas nos camundongos, tornando esses genes candidatos a protetores contra danos nos filamentos de actina desses animais. O aumento na expressão de uma protease (mast cell chymase) envolvida na degradação de matriz extracelular também pode estar relacionado com o fenótipo mais brando do Dmdmdx (Tseng et al., 2002).
O estudo do transcriptoma de pacientes com DMD de Bakay e colaboradores destacou vias relacionadas com o IGF, incluindo inibidores do IGF, o que pode explicar a hipertrofia observada nos pacientes; e também a indução de genes cardíacos, devido a uma série de fatores, como a infiltração de macrófagos, ativação das células-satélite, aumento de fibras lentas, e mudanças na homeostase das miofibras (Bakay et al., 2002).
Em estudo mais recente realizado por outro grupo utilizando um microarranjo de cDNA composto por 3500 genes expressos no músculo esquelético, foram encontrados 420
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genes diferencialmente expressos em pacientes com DMD. Mais uma vez, grande parte desses genes tem relação com a resposta imune, o sarcômero, a matriz extracelular e o crescimento celular. Genes ligados ao desenvolvimento estão superexpressos, enquanto que genes relacionados à homeostase do músculo estão subexpressos, o que reflete eventos celulares como necrose e regeneração (Noguchi et al., 2003).
Nas distrofias musculares, alguns músculos apresentam mais sinais de degeneração que outros. Na distrofia muscular de Duchenne, por exemplo, há comprometimento dos músculos dos membros e do diafragma, enquanto o músculo extraocular (EOM) é preservado. O padrão de expressão gênica do EOM de camundongos Dmdmdx mostra que
apenas sete genes apresentam expressão diferenciada, o que significa que a ausência de distrofina não provoca uma resposta exacerbada em nível transcricional nesse músculo. Sugere-se, portanto, que a proteção a este músculo venha de suas próprias diferenças constitutivas, que fornecem proteção contra danos devido à contração, em vez de adaptações moleculares (Porter, Merriam, Khanna, et al., 2003).
A natureza heterogênea da distrofia muscular de Duchenne, como o período de latência entre o nascimento e a manifestação de sintomas, a preservação de certos músculos, e diferenças na severidade entre as espécies, sugere que apenas a deficiência de distrofina é insuficiente para causar distrofia muscular. A avaliação temporal dos perfis de expressão do diafragma de camundongos revelou por volta de 700 transcritos diferencialmente expressos, com distribuição funcional semelhante à vista nos músculos dos membros posteriores. Porém, 50% dos transcritos aparecem nos dois grupos musculares, o que é consistente com a hipótese de que há uma divergência nos mecanismos em resposta à ausência de distrofina, a depender do músculo, mas as diferenças são atribuídas mais ao nível de variação da expressão, do que à natureza dos genes. Assim, a alteração de alguns transcritos pode tanto elevar (diafragma) ou diminuir (músculo extraocular) a sensibilidade do músculo à distrofia muscular (Porter et al., 2004).
Na tentativa de compreender por que cada músculo responde de maneira diferente à ausência de distrofina, Haslett e colaboradores estudaram os perfis de expressão gênica, em camundongos com deficiência de distrofina, dos músculos gastrocnêmio, quadríceps, sóleo, tibial anterior (TA), extensor dos dígitos (EDL) e diafragma individualmente. A análise mostrou que o gastrocnêmio, quadríceps, TA e EDL têm perfis similares. O sóleo e o diafragma diferem consideravelmente dos demais, mas são mais semelhantes entre si. As diferenças observadas não devem ser atribuídas apenas à proporção dos tipos de fibra que formam cada músculo; estudos mais detalhados são necessários para explicá-las (Haslett
et al., 2005).
A variabilidade no grau de severidade também é presente entre as diferentes formas de distrofia muscular. Com o objetivo de identificar os diferentes eventos
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moleculares responsáveis pelas distrofias musculares, foi feita a comparação dos perfis de expressão gênica de camundongos com deficiência de distrofina, sarcoglicanas, disferlina, sarcospan comparativamente a camundongos selvagens. Foi possível discernir dois grupos: o primeiro formado pelos animais com o fenótipo distrófico grave (distrofinopatia e sarcoglicanopatia), e o segundo, por animais com fenótipo brando ou não afetados (deficientes de disferlina e sarcospan, e selvagens). Em resumo, genes envolvidos na resposta inflamatória e organização estrutural estão significativamente hiper-regulados, enquanto genes de metabolismo estão hiporregulados (Turk et al., 2006).
Para caracterizar melhor os processos moleculares envolvidos na regeneração muscular, Turk e colaboradores estudaram a regeneração de camundongos Dmdmdx em nove tempos diferentes, entre uma e 20 semanas de idade. 166 genes diferencialmente expressos foram analisados mais detalhadamente, e a maioria desses genes tem o pico de expressão na idade de oito semanas, quando a regeneração atinge seu ponto máximo. A partir dessa análise foi visto que as vias do Notch-Delta, Bmp15 e Neuregulin estão ativadas e envolvidas na ativação, proliferação e diferenciação de células-satélite, diferentemente do que é visto em humanos. Assim, os autores propõem que a ativação dessas vias contribui para o maior sucesso regenerativo nos camundongos, o que poderia ser uma estratégia terapêutica interessante para humanos (Turk et al., 2005).
A proteína utrofina é homóloga à distrofina; por isso, acredita-se, que na ausência de distrofina, a superexpressão da utrofina possa trazer benefícios funcionais. O perfil de expressão de camundongos deficientes para distrofina, mas que superexpressam utrofina é bastante semelhante ao de camundongos selvagens. Logo, a superexpressão de utrofina pode ser uma terapia promissora para a deficiência de distrofina (Baban e Davies, 2008).
A tecnologia de microarranjos evolui rapidamente, com o surgimento de chips e programas computacionais de análise com coberturas mais completas dos genomas, permitindo análises cada vez mais complexas e refinadas, tornando necessária a repetição e reavaliação dos perfis de expressão gênica obtidos anteriormente.
A comparação do perfil de expressão de camundongos Dmdmdx no decorrer da evolução da doença, utilizando um microarranjo com cobertura total do genoma murino, mostrou que há uma forte indução de genes ligados à adesão celular, matriz extracelular, proteólise, estrutura muscular e regeneração, em relação a animais normais. Foi visto também que o Dmdmdx mantém a expressão de alguns genes que geralmente são suprimidos após o nascimento; e a natureza desses genes diferencialmente expressos provavelmente revela um mecanismo de resposta para reforçar a conexão entre o citoesqueleto e a matriz extracelular, na tentativa de proteger a fibra muscular contra os danos da contração muscular (Marotta et al., 2009).
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Pelo estudo de expressão gênica por microarranjo de músculos de pacientes com distrofia muscular de Duchenne e indivíduos idosos, Baron e colaboradores verificaram que há uma grande semelhança no perfil de expressão gênica entre esses dois grupos, sendo que a maioria dos genes coexpressos nos dois grupos está relacionada à resposta imunológica, à formação de fibrose e ao metabolismo mitocondrial. Isso sugere que processos patológicos distintos podem compartilhar um mesmo perfil gênico, com o envolvimento das mesmas cascatas de regulação. Além disso, os autores validaram seus resultados através de meta-análises, valendo-se de bancos de dados de microarranjos públicos (Baron et al., 2011).
Com o avanço das pesquisas genômicas em larga escala, diversas ferramentas de bioinformática vem sendo desenvolvidas para auxiliar na análise e interpretação do número gigantesco de dados gerados.
Kotelnikova e colaboradores desenvolveram uma nova forma de análise, baseada em redes de regulação proteína-proteína extraídas da literatura, que permite a identificação de reguladores, como fatores de transcrição, que também apresentem expressão diferencial. Assim, essa abordagem conecta genes diferencialmente expressos às principais vias implicadas e aos principais reguladores de expressão. Os autores aplicaram essa abordagem aos dados de perfis de expressão gênica de distrofia muscular de Duchenne e identificaram um conjunto de potenciais reguladores e biomarcadores da progressão e gravidade de DMD. Tais biomarcadores podem ser muito úteis em tratamentos e triagens clínicas, sendo usados para monitorar a eficiência de drogas e a escolha das doses corretas (Kotelnikova et al., 2012).
Com esses trabalhos podemos perceber o quão importante e delicada é a análise dos dados de expressão gênica global. A realização de meta-análises se torna cada vez mais interessante, tanto para fins de comparação com dados depositados em bancos públicos, quanto para fins de validação dos resultados obtidos. Além disso, é importante estar atento aos novos métodos de análise que surgem constantemente.
Portanto, a partir dos trabalhos avaliados, torna-se clara a importância da análise de transcriptomas para a melhor compreensão de mecanismos fisiopatológicos complexos. Por serem estudos de larga escala e de natureza exploratória, eles fornecem uma grande quantidade de dados, abrindo caminho para novas abordagens de pesquisa.
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Objetivos
Dado o contexto apresentado na seção anterior, os objetivos do presente trabalho consistem em analisar o perfil de expressão gênica do tecido muscular de camundongos modelos de distrofias musculares - Dmdmdx, Largemyd e Dmdmdx/Largemyd-/- em diferentes fases da progressão da doença, para identificar e analisar a função de genes diferencialmente expressos no fenótipo distrófico, contribuindo para um melhor entendimento dos processos patológicos nesses animais.