ESTUDOS in vitro

4.5.1 Teste de atividade antioxidante

Definição

A atividade antioxidante, por definição, é a capacidade que um composto tem de inibir a degradação oxidativa (ROGINSKY e LISSI, 2005). Ela pode ser avaliada através dos métodos ORAC- Oxygen Radical Absorbance Capacity (CAO et al, 1993); Autoxidação do Sistema β-caroteno/ácido linoléico (OLDONI, 2007); FRAP – Ferric Reducing Antioxidant Power (HUKKANEN, 2006); ABTS - 2,2’-azinobis-(3- ethybenzothiazoline-6-sulfonic acid (RE et al, 1999) e dentre esses podemos comentar o método doador de íon hidrogênio ao radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH; figura 93, pág. 101). Nesse método os radicais de DPPH, em solução metanólica, absorvem a 517 nm na região do ultravioleta. Na presença de substâncias antioxidantes ocorre uma mudança progressiva na cor da solução, de roxo para amarelo, sendo assim possível a quantificação dos radicais de DPPH remanescentes.

Experimento

A metodologia utilizada na avaliação da atividade antioxidante foi a do sequestro de radicais livres (HEGAZI et at, 2002) onde o radical utilizado foi o DPPH (2,2-difenil-1-picrilidrazila) na concentração de 60 µmol.L-1.

As amostras e os padrões foram submetidos a diluições (em metanol) para concentrações de 0,001 mg/mL, 0,005 mg/mL, 0,01 mg/mL, 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL e 1,0 mg/mL a partir de uma solução estoque com concentração conhecida. Em 1,0 ml, de cada diluição, foi adicionado 1,0 ml da solução metanólica de DPPH (60 µmol.L-1). Após 30 minutos foram realizadas medidas de absorbância.

A porcentagem de inibição (%) foi obtida pela razão entre a absorção da solução contendo amostra e a absorção da solução controle de DPPH sem amostra, subtraindo de um. Após o cálculo, foi construído um gráfico de porcentagem de inibição versus a concentração (Figuras 84 à 91, págs. 97 à 100). Para o cálculo do CI50 foi

utilizada a equação da reta, substituindo o valor de y por 50 para obtenção da concentração da amostra com capacidade de reduzir 50% do DPPH. Como padrões positivos de referência utilizaram-se Trolox (ácido 6-hidróxi-2,5,7,8-tetrametilcroman- 2-carboxílico) e Vitamica-C (ácido ascórbico), adquiridos da Sigma Aldrich.

O teste foi realizado pela doutoranda Macia Cleane Soares de Almeida no Laboratório de Biotransformações e Produtos Naturais do Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da UFC

4.5.2 Teste de atividade antiacetilcolinesterase Definição

A atividade antiacetilcolinesterase é a capacidade que um composto possui em inativar reversível e/ou irreversívelmente a enzima acetilcolinesterase. Ela pode ser avaliada qualitativamente e quantitativamente.

No método do teste qualitativo da cromatografia em camada delgada da antiacetilcolinesterase (CCD/AChE) por Rhee (2001) são utilizadas soluções dos reagentes ácido 5,5’-ditiobis-2-nitrobenzóico (DTNB), iodeto de acetilcolina (ATCI) em tampão, enzima AChE e o padrão fisostigmina. Na presença da enzima AChE, em meio aquoso, o iodeto de aceticolina é hidrolisado a ácido acético e tiocolina. Esse último, por sua vez, reage com o DTNB formando o ânion 5-tio-2-nitrobenzoato e o 2- nitrobenzoato-5-mercaptotiocolina. O ânion 5-tio-2-nitrobenzoato apresenta coloração amarela, sendo assim possível a comprovação da atividade enzimática, pois uma vez inibida a ação dela não ocorre à hidrólise do neurotransmissor, não é gerado a tiocolina e não se forma o ânion 5-tio-2-nitrobenzoato. Portanto, a inibição enzimática é observada pela presença de halos brancos (ausência do ânion 5-tio-2-nitrobenzoato) que são medidos e comparados com o halo branco do padrão (Figura 92, pág 101).

Experimento

A metodologia utilizada na avaliação da atividade antiacetilcolinesterase foi a do teste qualitativo da cromatografia em camada delgada da antiacetilcolinesterase descrita por (RHEE et al, 2001).

Amostra de 2 mg, de cada extrato e fração (provenientes das vagens), foi diluída em 1 mL de metanol. Uma alíquota de 1,5 mL, de cada diluição, foi aplicada em placa de cromatografia de camada delgada - CCD (plate, DC-Alufolien, Silica gel 60 F254, 0.2 mm Merck).

Uma mistura equimolecular das soluções 5,5’-ditiobis-2-nitrobenzóico - DTNB (1mM) e iodeto de acetilcolina - ATCI (1mM) foi pulverizada na CCD e após 5 minutos a solução enzima acetilcolinesterase AChE (5 U/ml) também foi pulverizada na mesma placa. Passados 10 minutos uma coloração amarela surgiu. Onde houve inibição da enzima, halos brancos apareceram. Fisostigmina, um alcalóide, foi usado como resultado positivo.

O teste foi realizado no Laboratório de Química de Produtos Naturais do Centro de Ciências e Tecnologia da Universidade Estadual do Ceará pela bolsista de iniciação científica Marina Maciel de Oliveira Silva sob orientação da Profª. Drª. Jane Eire Silva Alencar de Menezes e Profª. Drª. Maria da Conceição Tavares Cavalcanti Liberato.

4.5.3. Resultados e discussão

O extrato hexânico bruto e todas as frações testadas apresentaram atividade antioxidante com valores de CI50 de 2,09.10-3 à 5,46.10-3 sendo próximos ao valor

referente ao padrão Trolox 2,6.10-3 e menores do que o valor para o padrão vitamina C 4,3.10-2, dando-se ênfase para as frações hexano, acetato de etila e n-butanol que obtiveram, respecticvamente, 3,19.10-3, 2,09.10-3 e 2,37.10-3 (Tabela 9, pág. 95).

O CI50 representa a concentração necessária para neutralização de 50% dos

radicais de DPPH presentes na alíquota testada, logo quanto menor for esse valor mais eficaz será a amostra. Levando em consideração esse fato, verificamos a seguinte ordem, decrescente, de eficácia da amostra: Fr. AcOEt > Fr. n-BuOH > Fr. Hex > Fr. H2O/MeOH > Fr. DCM > Ex. Hex.

Os valores de CI50 foram obtidos utilizando-se a equação da reta correspondente ao

gráfico de porcentagem de inibição versus a concentração analisada para cada fração e padrão (Figuras 84 a 91, págs 97 a 100).

As frações Fr. AcOEt, Fr. n-BuOH, Fr. Hex e os padrões foram avaliados nas concentrações de 0,002 e 0,004 mg/ml porque em 0,005 mg/ml essas frações e padrões já apresentaram uma elevada porcentagem de inibição, diminuição essa que deveria ter sido realizadas também com a fração Hex. e o padrão Trolox, em concentrações entre 0,005 e 0,1 mg/ml, e com o extrato Hex, em concentrações entre 0,1 e 1,0 mg/ml, visto serem intervalos grandes de concentração.

As frações AcOEt e n-BuOH foram as que obtiveram maior porcentagem de inibição em menor concentração, e também o menor valor de CI50, se compararmos com

os valores para as demais frações. Já a concentração, para cada fração, em que melhor apresentou atividade, em meio a todas as concentrações testadas.

Estudos têm demonstrado que os compostos fenólicos são os principais responsáveis pela atividade antioxidante nos vegetais (TIVERON, 2010).

O extrato hexânico e todas as frações avaliadas apresentaram atividade antiacetilcolinesterase. Os tamanhos dos halos de inibição variaram de 0,6 a 0,9 cm, onde o maior valor corresponde também ao padrão utilizado (Tabela 10, pág. 96). As frações Fr. H2O/MeOH, MeOH e n-BuOH ocasionaram uma inibição de,

respectivamente, 0,8, 0,8 e 0,9 cm, sendo os valores mais significativos. Observamos que a fração n-BuOH, além de apresentar a maior atividade inibitória da AChE, teve o segundo menor valor de CI50 (2,37.10-3) e apresentou, em baixa concentração (0,005

mg/mL), uma porcentagem alta (98,0 %) de neutralização radicalar pressupondo, assim, uma relação entres as duas atividades avaliadas.

Algumas classes fitoquímicas podem levar a formação de falsos positivos quanto à degradação da enzima acetilcolinesterase, como a presença de taninos e compostos fenólicos, por promoverem a desnaturação da enzima (TREVISAN e

MACEDO, 2003), dessa forma o ácido gálico (ácido fenólico) e elágico (polifenol) não foram submetidos na avaliação da atividade antiacetilcolinesterase. Entretanto não podemos afirmar que os resultados de inibição enzimática obtidos para as frações Fr. AcOEt e n-Hex, onde foram isolados o ácido gálico e elágico, respectivamente, são justificados apenas pelo argumento da desnaturação, pois nas mesmas podem existir outras classes de metabólitos responsáveis pela inibição da AChE.

TABELA 9: Valores de porcentagem de inibição (%) e valores de CI50 (mg/mL).

CONC. /