empregado por Wilkins e foi definido como a caracterização em larga escala do conjunto total das proteínas das células, tecidos, ou organismos expressos em um tempo determinado e sob condições definidas (Wilkins et al., 1996; Kazmi e Krull, 2001). Trata-se de uma área interdisciplinar da ciência, na qual estão agregadas principalmente a química, biologia e informática (Tyers, 2003; Aebersold, 2003; Ong e Mann, 2005).
A necessidade de se realizar estudos proteômicos advém do fato de que os organismos têm vários mecanismos de controle das funções celulares e que as proteínas medeiam grande parte dos eventos biológicos que ocorrem na célula. Vários eventos celulares como modificações pós-transcricionais (splicing) e pós-traducionais (glicosilação, fosforilação, metilação), tradução de diferentes produtos proteicos a partir de único gene impedem que se faça corretamente correlação direta entre RNA e
proteínas, sendo necessários estudos que avaliem qualitativamente e quantitativamente perfis proteicos expressos em determinadas situações (Tannu e Hemby, 2006).
Inicialmente, o objetivo da pesquisa proteômica era identificar e caracterizar proteínas (Wu et al., 2006). Os avanços em cromatografia, espectrometria de massa e bioinformática permitiram que novos estudos pudessem ser realizados. Adicionalmente às técnicas tradicionais que eram capazes de investigar uma ou poucas proteínas ao mesmo tempo, o desenvolvimento de tecnologias proteômicas possibilitou a análise de um grande número e até mesmo de centenas proteínas, além de permitir a análise de múltiplas amostras. Mais do que a identificação de proteínas, novas técnicas desenvolvidas tornaram possível a quantificação de alterações da expressão de amostras proteicas.
A eletroforese bidimensional (2DE) é a técnica mais comumente usada em estudos proteômicos. Os fundamentos desta abordagem foram apresentados pela primeira vez por O’Farrell (1975) e Klose (1975) (O’Farrell, 1975; Klose, 1975). Desde então, têm-se verificado melhoramentos substanciais na qualidade e reprodutibilidade dos resultados obtidos, em consequência do desenvolvimento de equipamentos e reagentes específicos. Um desdobramento da 2DE é a chamada eletroforese diferencial em gel 2D (DIGE), que permite a marcação dos grupos lisina das proteínas com cianina (Cy) antes da focalização isoelétrica. Essa técnica permite a marcação de 2 a 3 amostras com diferentes corantes correndo-as no mesmo gel 2DE, reduzindo assim, variabilidade entre os padrões de spots entre os géis, além de diminuir o número de géis por experimento. Outra vantagem é a inclusão de uma amostra padrão em cada gel,
constituída de quantidades iguais de cada amostra experimental comparada e que é usada para normalizar as medidas de abundância de proteínas entre vários géis de um experimento (Wu et al., 2006).
Outros métodos de quantificação de proteínas foram descritos recentemente. O iCAT (Isotope-coded affinity tags) é baseado na adição de uma etiqueta que tem afinidade por resíduos de cisteína e que possui uma molécula ligada de oito átomos de hidrogênio ou oito átomos de deutério (cadeia leve e pesada). Uma amostra é marcada com a etiqueta contendo hidrogênio e a outra amostra com a etiqueta contendo o deutério. Após digestão das proteínas, os peptídeos resultantes são identificados por MS. Peptídeos iguais marcados nas duas amostras são identificados pela sobreposição dos picos que apresentaram m/z (razão massa-carga) distintas devido ao tipo de isótopo ligado, sendo a relação entre a área dos dois picos uma medida relativa da expressão daquela proteína (Yi e Goodlett, 2004).
Essa técnica possui algumas desvantagens como a não identificação de proteínas com pouco ou nenhum resíduo de cisteína; a perda de informações de modificações pós- traducionais e complicada interpretação dos resultados MS/MS devido à adição do grupo biotina. A adição de um novo sítio de clivagem com emprego de isótopos 13C (cICAT) e um grupo biotina com clivagem ácida foram modificações da técnica para tentar minimizar suas limitações (Yi e Goodlett, 2004).
O iTRAQ (Isobaric tags for relative and absolute quantitation) também é uma técnica baseada na marcação de proteínas com etiquetas e identificação por MS. Os reagentes (4-plex ou 8-plex) são isobáricos e adicionam uma massa de 145 Da ao peptídeo após marcação (Schmid e Urlaub, 2009). Essas etiquetas se ligam à porção N- terminal dos grupos amina livres de todos
os peptídeos e nas cadeias laterais internas com resíduos de lisina. As etiquetas variam em função do grupo reporter que carregam, podendo ter 114, 115, 116 ou 117 Da, o que possibilita a quantificação de proteínas em até quatro tipos de amostras ao mesmo tempo. A quantificação relativa é realizada da mesma forma que no iCAT.
Aliada aos géis bidimensionais e outros métodos de quantificação de proteínas, a espectrometria de massa (MS) tem se mostrado ferramenta ideal para aplicações protêomicas, fato este atribuído a sua capacidade de analisar proteínas e peptídeos com alta especificidade, precisão, velocidade e sensibilidade. Apesar da MS ser uma técnica centenária, sua aplicabilidade na análise de proteína tornou-se notória e praticamente imprescindível somente depois do desenvolvimento das técnicas brandas de ionização (ESI – Electrospray ionization e MALDI – Matrix Assisted Laser Desorption Ionization), ocorridas no final dos anos 1980.
A partir do aprimoramento do 2DE com o emprego de tiras IPG (gradiente de pH imobilizado), do desenvolvimento de variações da técnica como o emprego de corantes mais sensíveis como SYPRO Ruby, DIGE, e de outras técnicas de quantificação como iCAT e iTRAC que aumentaram a capacidade de resolução e sensibilidade, e também do MALDI-MS que permitiu a identificação rápida e em larga escala de proteomas inteiros, estudos proteômicos objetivando a determinação do perfil de expressão de proteínas das espécies de Brucella e da interação bactéria-hospedeiro têm sido extensivamente realizados.