Etapa 2: Análise preliminar do teor de metais em tecidos de C danae

Foram utilizados dez indivíduos da espécie C. danae provenientes de coleta realizada na região próxima ao rio Mariana (23° 57,521'S, 46°25,073'W), no canal de São Vicente (FIG. 4).

FIGURA 4: Estuário de Santos. O ponto em amarelo indica o local de coleta com rede de arrasto, a qual também contemplou indivíduos da espécie C. danae (Fonte: Google Earth).

A identificação destes organismos foi feita de acordo com Melo (1996). Os siris foram mensurados quanto a peso total, largura (desconsiderando os espinhos) e comprimento da carapaça (FIG. 5a). O sexo foi identificado segundo Willians (1974) e estágio de maturação de acordo com a forma e o grau de aderência do abdome aos esternitos torácicos (FIG. 5 b, c, d). Os indivíduos foram congelados a -20ºC.

FIGURA 5: C. danae, com indicações de largura sem espinhos (LC) e comprimento (CC) da carapaça (a); sexo e estágio de maturação conforme forma e aderência do abdome (b=macho, com abdome em T; c= fêmea imatura, com abdome triangular; d=fêmea madura, com abdome oval).

Antes da manipulação dos indivíduos, a capela de exaustão foi limpa com detergente e água, com posterior aplicação de álcool 70 %. Foi instalado papel contact transparente nas paredes da capela e sua superfície foi limpa com HNO3 10%, para evitar contaminação. Após descongelamento das amostras,

brânquias, músculos e hepatopâncreas dos siris foram acessados, abrindo suas carapaças a partir de seus abdomes (FIG. 6 a, b, c).

Os tecidos foram retirados utilizando-se pinça cirúrgica (FIG. 6 d, e). As partes foram separadas em pequenas embalagens tipo zip lock (FIG. 6 f), identificando o número do indivíduo e a letra inicial do tecido correspondente (B, H ou M) com papel vegetal.

LC

FIGURA 6: Dissecação de C. danae e separação dos tecidos a b c d f e

Para o processo de digestão ácida, foram pesados 0,5-1,0 g de cada tecido e 0,5g de materiais de referência certificados diretamente nos tubos de Teflon de microondas, já devidamente descontaminados. Baseado no método 3052 (U.S.EPA, 1996), foram adicionados aos tecidos 5 mL de HNO3 sub boiling

(65%) e 3 mL de H2O2 (30%). Os tubos de Teflon foram tampados, deixando os

tecidos pré-digerindo de um dia para o outro (aproximadamente 8h). Após este período, adicionou-se aos tubos 2 mL de água tipo Milli-Q, a 18 MΩ.cm em 25 °C.

A digestão das amostras foi realizada em sistema de microondas (CEM Corporation, modelo MARS 5). Após digestão, os tubos foram colocados na capela de exaustão até total resfriamento. Após resfriamento, os extratos dos tubos de Teflon foram transferidos para tubos tipo Falcon, em balança analítica. Água Milli-Q foi adicionada aos extratos até atingir 20 g, alcançando uma acidez aproximada de 25%.

Após serem lavados em água corrente, os tubos de Teflon foram lavados três vezes com água Milli-Q para a descontaminação. As tampas e as roscas de segurança foram imersas em água Milli-Q. A secagem dos tubos ocorreu em capela, na temperatura ambiente. As tampas e roscas de segurança foram secas em ar comprimido. Adicionou-se de 10-15 mL de HNO3 10% nos

tubos de Teflon secos, os quais foram colocados no sistema de microondas para limpeza. Ao final deste procedimento, os tubos foram colocados na capela até total resfriamento. Após resfriamento, transferiu-se o ácido para frascos de plástico de descarte. Os tubos foram novamente lavados em água Milli-Q. As tampas e roscas de segurança foram imersas em água Milli-Q. Os tubos, tampas e roscas de segurança foram secos em capela. Em alguns casos, fez-se uso de ar comprimido para secar tampas e roscas.

Na análise química dos tecidos de siri, foram mensurados os seguintes metais: Al, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Hg, Ni, Pb e Zn.

Os elementos Al, Cd, Cr, Co, Ni e Pb foram mensurados por meio de um espectrômetro de massa de alta resolução com fonte de plasma indutivamente acoplado (HR-ICPMS), marca Thermo Finnigan, modelo Element 1. Os elementos Cu, Fe e Zn foram analisados por meio de um espectrômetro de absorção atômica de chama “fast sequential” (AAS) marca Varian, modelo Spectr-

AAS-220-FS. O elemento Hg foi analisado utilizando-se CV AAS, acoplado a um sistema de injeção em fluxo com geração de vapor frio (FIA).

As amostras foram analisadas no AAS em sua diluição original (aproximadamente 25% de acidez, como anteriormente descrito). Já para análise em HR-ICPMS, foi retirada uma massa de 1g da diluição original e completou-se o volume até 10g com água Milli-Q, atingindo uma acidez de cerca de 2,5%. Os brancos (sete, no total) foram submetidos aos mesmos procedimentos, contendo apenas ácido, água oxigenada e água Milli-Q, sem nenhuma amostra.

A validação deste método foi feita analisando-se materiais de referência certificados (Oyster tissue – NIST SRM 1566a_{; Lobster hepatopancreas}

– NRC TORT-2).

O limite de detecção (LD) para cada metal foi calculado de acordo com a equação descrita em INMETRO (2011):

LD = média + t (n-1; 1-α) x DP

Média = média de concentrações medidas em 7 brancos

t = valor de t de Student de acordo com os graus de liberdade (n-1) e α = 0,05 DP = desvio padrão das concentrações medidas em 7 brancos

Numa avaliação toxicológica preliminar, as concentrações de metais obtidas foram comparadas aos limites máximos de contaminantes inorgânicos em crustáceos segundo o Decreto no 55.871, de 26 de março de 1965 (Brasil, 1965); a Portaria nº 685, de 27 de agosto de 1998 (Brasil, 1998); a Resolução - RDC Nº 42, de 29 de agosto de 2013 (que revogou os limites máximos de Cd, Pb e Hg que constam no anexo da referida portaria) (Brasil, 2013) e o regulamento nº 1881/2006 da União Europeia (European Union, 2006).De modo a detectar relações entre os tipos de tecido e essas concentrações, foi realizada a análise de componentes principais (APC) utilizando o programa STATISTICA12 (Statsoft). Antes desta análise, os dados de concentrações de metais nas brânquias, hepatopâncreas e músculos foram padronizados, como anteriormente descrito.