Etapas da clonagem e seqüenciamento

As etapas de clonagem (adenilação, ligação do vetor plasmidial, transformação da E. coli e amplificação do DNA plasmidial) e seqüenciamento foram realizadas apenas para a amostra da última fase de operação (16,4 mg/L de LAS com apenas sacarose como co- substrato) retirada do material suporte. A seleção desta amostra para realização dos procedimentos citados acima se deu em virtude da possibilidade de melhor representar a diversidade microbiana presente no reator.

O fluxograma dos procedimentos laboratoriais até chegar à etapa de seqüenciamento pode ser visualizado na Figura 4.4.

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Figura 4.4: Fluxograma com as etapas da clonagem até o seqüenciamento

4.9.7.1 Clonagem

As amostras de produtos de PCR purificados foram clonadas por meio do plasmídeo pGEM Easy Vector System I (50ng).

A adenilação dos fragmentos foi realizada utilizando os seguintes reagentes: 3µL do produto de PCR, 1 µL de tampão PCR (10X) com MgCl2, 1 µL de ATP (5mM), 1 µL de TaqDNA polimerase e 4 µL de água purificada estéril. O “mix” foi incubado a 70 ºC por 30 minutos em termociclador.

O próximo passo foi a ligação do vetor pGEM aos fragmentos de RNAr 16S. O produto de PCR adenilado (2µL) foi adicionado a 5 µL de 2x Rapid Ligation Buffer, 1 µL de pGEM Easy Vector System I, 1 µL de T4 DNA ligase (3 weiß units/µL) e 1 µL de água ultra purificada. Esta solução foi misturada cuidadosamente com pipeta e incubada por 1 hora a temperatura ambiente.

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A transformação em células competentes de E. coli, anteriormente armazenadas a -80 ºC, foi realizada seguindo os seguintes passos:

a) Manutenção em banho de gelo por 5 minutos;

b) Mistura de 2µL do produto de ligação com as células E. coli; c) Incubação no gelo por 20 minutos;

d) Banho-maria a 42 ºC por 50 segundos e sem agitação das células; e) Agitação manual dos tubos e banho de gelo por 2 minutos;

f) Adição de 200 µL de meio Luria-Bertani (LB) (sem ágar) (Tabela 4.13) na temperatura ambiente;

g) _{Incubação do meio juntamente com as células a 37 ºC por 90 minutos em agitação} automática (150 rpm).

Tabela 4.13: Composição do meio Luria-Bertani (LB)

Nutrientes Concentração (g/L)

Triptona 10

Extrato de Levedura 5

Cloreto de Sódio 5

Ágar 15

Ao término da etapa anterior que fora descrita acima, 150 µL do material transformado foi adicionado a 50 mL de meio LB contendo os seguintes reagentes: 64 µL de Xgal (40 mg/mL); 80 µL de IPTG (23 mg/mL) e 30 µL de ampicilina (50 mg/mL). Esta nova solução foi dividida em duas placas de Petri (25 mL da solução em cada uma) que foram incubadas a 37 ºC por 24 horas.

As placas foram retiradas da estufa e submetidas a 4 ºC por 1 hora a fim de intensificar a tonalidade das colônias azuis. As colônias brancas (característica de células com presença do vetor pGEM no meio intracelular) foram pinçadas e transferidas para tubos de ensaio contendo meio LB líquido (5 mL) e 3 µL de ampicilina (50 mg/L). Estes foram incubados a 37 ºC por 16 horas em agitação mecânica (150 rpm) dentro de câmara de germinação.

Após o período de incubação, foi verificada a turvação do meio nutriente. O conteúdo dos tubos de ensaio foi transferido para tubos eppendorf e as amostras foram centrifugadas para retirada do DNA plasmidial.

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A confirmação da presença de material genético nas amostras ocorreu por meio de eletroforese em gel de agarose 1 %. Para tanto, o DNA plasmidial foi amplificado por PCR utilizando os primers M13f e M13r (Tabela 4.14) e o “mix” descrito na Tabela 4.12 (excetuando os primers 27f e 1100r). A programação do termociclador para realizar a amplificação do material genético é descrito na Tabela 4.15.

Tabela 4.14: Primers utilizados na amplificação do DNA plasmidial

Primers Seqüências (5’→ 3’)

M13F 5’ – CGC CAG GGT TTC CCC AGT CAC GAC – 3’

M13R 5’ – TTT CAC ACA GGA AAC AGC TAT GAC – 3’

Fonte: Chun (1995)

Tabela 4.15: Descrição das etapas do termociclador para os primers M13f e M13r Nº de

ciclos

Desnaturação inicial

Desnaturação Anelamento Extensão Resfriamento

30 94 ºC, 3 min 94 ºC, 20 s 60 ºC, 20 s 72 ºC, 90 s 4 ºC, ∞

4.9.7.2 Seqüenciamento

As amostras que apresentaram bandas de aproximadamente 800 bp foram selecionadas e enviadas à empresa MacroGen Inc. localizada na Coréia do Sul para realizar o seqüenciamento.

Os arquivos das amostras já seqüenciadas mandadas pela empresa vieram no formato .abi e foram trabalhadas no programa SeqMan com a retirada de regiões de poliadenilação e seqüências do vetor e SNPs (polimorfismos de nucleotídeo único). Após este procedimento, foi elaborado um banco de dados no formato .fasta com as seqüências selecionadas no SeqMan.

O banco de dados obtido foi comparado com o banco de dados do RDP-project (Ribossomal Database Project) utilizando a ferramenta SEQMATCH para estabelecer relações taxônomicas (http://rdp.cme.msu.edu/seqmatch/seqmatch_intro.jsp

As seqüências foram alinhadas por meio da ferramenta ALIGNER do RDP-project (

).

http://pyro.cme.msu.edu/spring/align.spr) que usa o método de alinhamento Infernal (“INFERence of RNA ALignment”) (NAWROCKI; EDDY, 2007).

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A definição de unidades taxonômicas operacionais (UTOs) foi obtida utilizando a ferramenta COMPLETE LINKAGE CLUSTERING do RDP-project (http://pyro.cme.msu.edu/spring/cluster.spr). A formação dos clusters foi realizada por meio método de “complete-linkage”. Os números de UTOs bem como as seqüências de cada UTO foram encontrados admitindo-se 0,03 como sendo a distância evolutiva.

A curva de rarefação das UTOs foi determinada com objetivo de verificar a abrangência de cobertura dos clones em função da diversidade presente no reator. Ela foi obtida com ajuda da ferramenta RAREFACTION do RDP-project (http://pyro.cme.msu.edu/spring/rarefaction.spr).

Apenas as seqüências representativas de cada UTO foram consideradas, ou seja, aquelas que minimizam a soma do quadrado das distâncias de todos os membros de uma determinada UTO. Para tanto, a ferramenta DEREPLICATE do RDP-project foi utilizada (http://pyro.cme.msu.edu/spring/derep.spr). As seqüências representativas de cada UTO foram relacionadas com banco de dados do NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).

As seqüências das UTOs e do NCBI foram alinhadas conjuntamente por meio do CLUSTAL W (HIGGINS et al., 1994). A árvore filogenética foi realizada por meio do software MEGA 4 (TAMURA et al., 2007) utilizando o método Neighbor-Joining (SAITOU; NEI, 1987) de agrupamento das seqüências, bootstrap de 100 amostragens e distâncias evolucionárias computadas pelo método Kimura 2-parameter (KIMURA,1980).

4.10 Análises estatísticas

Os valores das médias de remoção de DQO e LAS obtidos em cada etapa (exceto na fase de imobilização da biomassa) bem como aqueles advindos de Carosia (2011) foram submetidos a diferentes análises estatísticas: 1) os dados de LAS e DQO foram comparados por box-plot; 2) teste Anova-one way para verificação de diferença significativa no conjunto de valores; e 3) teste Scheffé para comparação de diferença significativa das médias par a par, ou seja, a média de um conjunto de dados advindo de uma determinada configuração de água residuária era comparada apenas com uma outra por vez, formando pares.

O teste Scheffé foi utilizado para tentar responder duas perguntas principais: existiu pareamento com diferença estatística relevante? É possível inferir qual fator (co-substrato ou LAS) foi mais importante para explicar uma possível diferença estatística relevante entre duas configurações de águas residuárias distintas ao serem pareadas?

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Os dados de monitoramento do reator obtidos a partir das análises de alcalinidade, remoção de LAS, pH, ácidos totais voláteis, potencial redox e remoção de DQO das etapas II, III e IV foram submetidos à análise de componentes principais (ACP). O ACP foi utilizado afim de visualizar quais dos fatores descritos na frase anterior (alcalinidade, remoção de LAS, pH, ácidos totais voláteis, potencial redox e remoção de DQO) promoveram maior variabilidade dos dados de monitoramento, ou seja, quais desses fatores foram preponderantes em cada etapa e, por conseguinte, ajudaram a descrever melhor os processos físico-químicos e biológicos que aconteceram dentro do reator.

42 5. Resultados e Discussão