3 MATERIAIS E MÉTODO
3.2. Exame laboratorial
A técnica de Soroaglutinação Microscópica (SAM) em campo escuro foi realizada no Laboratório de Zoonoses Bacterianas do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal da Faculdade de Medicina veterinária e Zootecnia (FMVZ) da Universidade de São Paulo (USP).
A SAM foi utilizada para a mensuração dos níveis de aglutininas soros dos cães. Foram utilizadas para tal, culturas de antígenos vivos constituídos por 24 sorovares de leptospiras, sendo 22 sorovares de leptospiras patogênicas e dois de leptospiras saprófita.
As culturas vivas de leptospiras foram mantidas em meio líquido de EMJH modificado, com 4 a 14 dias de crescimento e uma densidade aproximada 100 a 200 microrganismos por campo microscópico, com aumento de 400 vezes.
Os soros foram diluídos a 1:50 em solução salina tamponada de Sorensen. A reação foi efetuada em microplacas de poliestireno com 96 poços, com 50 µL de antígeno, a diluição final da mistura soro/antígeno 1:100, sendo este o ponto de corte da reação.
Os soros positivos na triagem foram titulados em uma série de diluições geométricas de razão dois. A recíproca da maior diluição do soro que apresentar 50% de leptospiras aglutinadas foi considerada como o título do soro. As placas foram incubadas em estufa a 28-30°C por três horas. As leituras foram realizadas em microscópio de campo escuro, no aumento de 100 vezes, observando-se a formação de aglutinação. Para a caracterização do sorovar mais provável, levou-se em conta, o sorovar que apresentou maior título e o maior número de animais caracterizados como sororreagentes.
Neste enfoque, o quadro a seguir representa a relação dos sorovares de leptospiras utilizadas como antígenos no SAM aplicado ao diagnóstico de leptospirose.
Espécie Sorogrupo Sorovar Estirpe utilizada
L.interrogans
Australis Australis
Ballico
Bratislava Jez Bratislava
Autumnalis Autumnalis Akiyami A
Butembo Butembo
Ballum Castellonis Castellon 3
Bataviae Bataviae Van Tienen
Canicola Canicola Hond Utrecht IV
Celledoni Whitcombi Whitcombi
L. kirschneri Cynopteri Cynopteri 3522C
Grippotyphosa Grippotyphosa Moskova V
L.interrogans
Hebdomadis Hebdomadis Hebdomadis
Icterohaemorrhagiae Copenhageni M-20
Icterohaemorrhagiae RGA
Javanica Javanica Veldrat Bat 46
Panama Panama CZ 214K
Pomona Pomona Pomona
Pyrogenes Pyrogenes Salinem
Sejroe
Hardjo Hardjoprajitno
Wolffi 3705
Shermani Shermani LT 821
Tarassovi Tarassovi Perepelicin
Djasiman Sentot Sentot
L.biflexa Andamana Andamana CH 11
Seramanga Patoc Patoc-1
4 RESULTADOS
Vinte e três amostras foram sororreagentes à Leptospira spp., pelo SAM aplicado ao diagnóstico da leptospirose, obtendo-se prevalência de 13,44%, com maior frequência dos sorovares Canicola (30,4%), Pyrogenes (17,4%), Hebdomadis (13%), Cynopteri (8,7%), Icterohaemorrhagiae (8,7%) e Wolffi (8,7%). Também foram encontradas reações positivas para os sorovares Grippotyphosa e Shermani ambos com um sororreagente (4,3%). Os títulos de anticorpos das reações variaram de 100 a 1600.
Na tabela 1 encontram-se os resultados obtidos da frequência de aglutininas anti-Leptospira spp em 172 amostras de soro de cães mantidos em abrigo coletivo no município de Barbacena, MG, segundo o sorovar e seus respectivos títulos.
Tabela 1 Frequência de aglutininas contra Leptospira spp em 172 de amostras de soro de cães mantidos em abrigo coletivo reagentes pela técnica de soroaglutinação microscópica em campo escuro aplicada à leptospirose no município de Barbacena, MG, segundo o sorovar e seus respectivos títulos – São Paulo, 2016.
Sorovar Título Total (%)
100 200 400 800 1600 Canicola 2 1 2 2 7 (30,4) Pyrogenes 1 2 1 4 (17,4%) Hebdomadis 1 1 1 3 (13%) Cynopteri 1 1 2 (8,7%) Icterohaemorrhagiae 2 2 (8,7%) Wolffi 1 1 2 (8,7%) Grippotyphosa 1 1 (4,3%) Shermani 1 1 (4,3%)
5 DISCUSSÃO
Na realização do estudo sorológico da leptospirose em cães recolhidos e mantidos no abrigo público no município de Barbacena, foram analisadas 172 amostras dos cães da ABPA, o que representou uma análise de 100% dos cães do abrigo. A ABPA recolhe e mantém os cães que se encontram nas ruas de Barbacena, realizando um trabalho voluntário com profissionais de diversas áreas, com a finalidade de cuidar dos animais 2,4.
Das 172 amostras analisadas neste estudo, 23 (13,44%) foram sororreagentes, para pelo menos um sorovar, com títulos que variaram de 100 a 1600. A prevalência obtida está de acordo com os resultados encontrados em populações caninas no Brasil que variam em torno entre 10% e 22% 22.
Os sorovares encontrados com maior frequência no município estudado foram Canicola 30,4%, Pyrogenes 17,4%, Hebdomadis 13%. Os sorovares Cynopteri, Icterohaemorrhagiae e Wolfi apresentaram uma frequência de 8,7% e Grippotyphosa e Shermani, ambos com 4,3%.
Dados similares para o sorovar Canicola (16%) foram obtidos no município de Santana de Parnaíba por Mascolli et al (22), em 1999, com a realização de uma análise para se determinar o perfil epidemiológico e os fatores de risco que podem vir condicionar ao surgimento da leptospirose nos cães.
No estudo de Batista et al (9), a prevalência da leptospirose em cães errantes na cidade de Patos, na Paraíba, foi de 20%, sendo que, os maiores percentuais de reagentes foi observado nos animais provenientes da periferia da cidade, relacionado-se a fatores que se ligam à deficiências sanitárias e saneamento básico. No entanto, não foram encontradas reações para o sorovar Canicola o que discorda dos resultados obtidos no presente trabalho, dado que surpreende, uma vez que, os cães são considerados hospedeiros de manutenção do sorovar Canicola, e em regiões onde estes animais não são vacinados, a leptospirose ocorrida pela
presença desse sorovar ocorre em índices percentuais entre 50% a 75% 4, 5, 6, 7, 8, 9, 22
.
Dentre os diversos estudos sorológicos realizados na população canina brasileira, observa-se uma predominância da variabilidade da distribuição de sorovares de Leptospiras spp. 6, 8, 9,10, 15, 17. Entretanto, a leptospirose ocorre em razão da presença de sorovares, que têm como fonte de infecção os cães e roedores, sejam estes presentes em esgotos, camundongos ou ratos pretos de telhados 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 15, 17, 19, 22.
A prevalência de 8,7% para o sorovar Icterohaemorrhagiae como as descrito em outros estudos por Batista et al. (2,5%) (9) e Lemos, Melo, Viega (17) (14%), alerta para a ocorrência de sérios problemas de saneamento básico e consequente proliferação de animais portadores de leptospiras, pois estes podem ser os responsáveis pela maior ocorrência do agente nas cidades. Os ratos e em especial as ratazanas são tidos como os maiores portadores de leptospiras e considerados um dos principais responsáveis pela transmissão da doença ao homem.
Batista et al (9) também encontraram reações para outros sorovares considerados acidentais para cães como Hebdomadis (7,5%), Cynopteri (2,5%) e Shermani (7,5%) e Grippotyphosa (10%) dados também relatados, na cidade de Salvador, por Lemos, Melo, Viega (17), com frequência de 7% Grippotyphosa e 0,5% para Wolffi.
O aparecimento do sorovar Grippotyphosa, que normalmente circula na população de animais silvestres, nos cães testados, indica contato entre a população canina e os animais silvestres (9). Este fato pode estar associado ao crescimento dos grandes centros urbanos em direção a áreas peri-urbanas, o que proporciona um maior contato dos cães com animais silvestres que frequentemente habitam os domicílios atraídos por restos de alimentos.
O sorovar Wolffi apresenta alta ocorrência entre os cães do meio rural. Os bovinos são considerados os hospedeiros de manutenção do sorovar Hardjo e Wolffi
(24)
. Na região do presente estudo, observou-se uma frequência para este sorovar de 8,7%, sugerindo a hipótese da transmissão entre as espécies bovina e canina.
A análise dos resultados obtidos no presente trabalho permite concluir que a leptospirose é endêmica no municipio de Barbacena, MG e que mesmo com aumento na frequência de outros sorovares, considerados acidentais para cães, os sorovares Canicola e Icterohaemorrhagiae continuam com altos índices de prevalência na região do presente estudo.
Na profilaxia da leptospirose em cães, é importante que haja saneamento do ambiente, com um foco no combate e controle de roedores que possam vir a transmitir a doença nos animais 5, 6, 7, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.
Para que se haja a prevenção da leptospirose nos cães, é importante que seja aplicado aos animais a vacinação, esta entendida como uma técnica eficaz de controle da doença nos cães 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.
6 CONCLUSÃO
No inquérito soro epidemiológico realizado na população canina mantida em abrigo público no município de Barbacena, MG, foi obtido as seguintes conclusões:
- Os resultados deste estudo indicam que a leptospirose encontra-se disseminada nos cães recolhidos pelo abrigo público.
- Foram encontrados cães sororreatores para leptospirose com taxas de prevalência de 13,44% e títulos de anticorpos com variação de 100 a 1600.
- Os sorovares de leptospiras mais frequentes nas amostras de soros caninos analisadas foram, em ordem decrescente de ocorrência, Canicola, Pyrogenes, Hebdomadis, Cynopteri, Icterohaemorrhagiae e Wolffi.
- Os sorovares Grippotyphosa e Shermani foram encontrados em menor frequência.
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ANEXO A