EXAMES LABORATORIAIS

Após a consulta médica, os pacientes se dirigiam ao Laboratório de Plaquetologia da Gerência de Malária da FMT-AM, onde era coletado material biológico para a realização dos exames laboratoriais necessários ao estudo, cujos

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resultados eram registrados na mesma ficha clínica utilizada para o registro dos dados clínicos (Anexo B).

Para o diagnóstico da malária, pela gota espessa, a partir de uma gota de sangue coletada por punção digital, foi utilizado o método de coloração de Walker (48), descrito no Procedimento Operacional Padrão nº 001 do Laboratório de Plaquetologia da Gerência de Malária (MAL/PLA-POP-001) (Anexo C). As lâminas foram observadas inicialmente, antes da inclusão, por um dos microscopistas do Laboratório de Microscopia da Gerência de Malária, e a parasitemia era semi- quantificada em cruzes. Após a inclusão do paciente, a lâmina previamente confeccionada era recolhida e novamente observada, sempre por um mesmo microscopista experiente da Gerência de Malária, que ademais, fazia a quantificação da parasitemia por microlitro, segundo método descrito no mesmo MAL/PLA-POP- 001. Na presença de gametócitos ou esquizontes de P. falciparum, fazia-se o registro na ficha clínica.

Foram coletados a vácuo (BD Vacutainer®_{) 4,5 mL de sangue venoso}

periférico em tubos de vidro siliconados, com K2EDTA. Imediatamente, se misturava

a amostra de sangue ao anticoagulante contido no tubo, por inversão. A realização dos hemogramas não superou 2 horas após a coleta do sangue, sendo os tubos mantidos em temperatura ambiente. O cuidado foi semelhante com todas as amostras coletadas. Os hemogramas foram realizados no Laboratório de Análises Clínicas da FMT-AM, em aparelho automatizado PENTRA 120-Retic®_{, da ABX}

Adicionalmente, se realizava um esfregaço, a partir do sangue com anticoagulante, para a contagem diferencial das células brancas, em caso de flag pelo aparelho (sinalização da necessidade de confirmação manual quando há na amostra leucócitos atípicos ou imaturos). O mesmo esfregaço foi utilizado para a pesquisa de evidências morfológicas de pseudo-plaquetopenia induzida por EDTA, como satelitismo plaquetário (plaquetas aderidas à superfície dos leucócitos). A análise do esfregaço foi realizada apenas nos casos em que se observou diminuição da contagem de plaquetas, ao hemograma.

Considerou-se anêmico o paciente com hemoglobina menor que 12 g/dL (mulheres) ou menor que 13 g/dL (homens). Anemia grave, de acordo com a OMS, foi considerada quando a dosagem de hemoglobina foi menor que 7 g/dL. A leucocitose foi considerada quando a contagem de leucócitos totais foi maior que 12.000/µL, a linfocitose quando o percentual de linfócitos foi maior que 35% e a neutrofilia, quando o percentual de neutrófilos foi maior que 70%. Considerou-se plaquetopenia quando a plaquetimetria foi menor que 150.000/µL. Categorizou-se a plaquetopenia em leve (100.000-150.000/µL), moderada (50.000-100.000/µL) e grave (<50.000/µL) (126).

Foram coletados a vácuo (BD Vacutainer®_{) 4,5 mL de sangue venoso}

periférico em tubos de vidro sem anticoagulante, com gel separador. Após 20 minutos em repouso, para a coagulação do sangue, procedia-se à centrifugação a 1000 g por 15 minutos, para a retirada do soro, utilizado para a dosagem de bilirrubinas totais, glicose e creatinina (utilizados como critérios laboratoriais de

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malária grave pela OMS). Os exames bioquímicos foram realizados no Laboratório de Análises Clínicas da FMT-AM, em aparelho automatizado DIMENSION AR® _da

Dade Behring®_{, utilizando kits comerciais da mesma empresa. São valores normais}

de referência do aparelho: bilirrubinas totais até 1,2 mg/dL; glicose entre 70 e 110 mg/dL; creatinina entre 0,6 e 1,3 mg/dL. Entretanto, para o diagnóstico de malária grave, utilizou-se a recomendação da OMS: bilirrubinas totais acima de 5,0 mg/dL, glicose abaixo de 40 mg/dL e creatinina acima de 3,0 mg/dL. O restante do soro foi armazenado em freezer a -20ºC para a realização da dosagem de ICC e dos exames sorológicos para HIV, hepatite B, hepatite C e dengue.

Em outro tubo com citrato de sódio a 3,2%, coletaram-se mais 4,5 mL de sangue venoso periférico, a vácuo (BD Vacutainer®_{). Imediatamente, se misturava a}

amostra de sangue ao anticoagulante contido no tubo, por inversão. Em seguida, se centrifugava o material a 1500 g, por 10 minutos, para a obtenção do plasma. Uma alíquota do mesmo era utilizada para a realização da dosagem semi-quantitativa do TAP e do TTPA, no Laboratório de Análises Clínicas da FMT-AM, em aparelho FIBRIN-TIMER II® _{da Dade Behring}®_{. O RNI foi calculado a partir da razão entre o}

TAP do paciente (em segundos) e o TAP controle de 100% de um pool de pacientes normais controles testado no mesmo laboratório (11,3 segundos), elevado a 0,97 (índice de sensibilidade internacional – ISI - da tromboplastina Thromborel S ® _da

Dade Behring®_).

Considerou-se como distúrbio de coagulação o paciente que tivesse RNI maior que 1,26 ou TTPA maior que 34 segundos.

Para a confirmação do diagnóstico de malária vivax ou falciparum, por PCR, utilizou-se a técnica descrita por Snounou e cols., em 1993 (334), detalhada em MAL/MOL-POP-001 (Anexo C). Nos casos de PCR evidenciando malária mista (vivax e falciparum), repetiu-se o exame para a confirmação da dupla infecção. A PCR foi realizada a partir de papa de hemácias coletada do fundo do tubo com citrato de sódio a 3,2%, após a retirada do plasma.

Para a realização do teste de sangramento (TS), foi utilizada a técnica de Duke (99). Fazia-se a assepsia da polpa digital com álcool a 70% e com uma lanceta estéril perfurava-se o local desinfetado, deixando o sangue fluir livremente. No momento da picada, era acionado um cronômetro. Usando papel de filtro, secava-se de trinta em trinta segundos a gota de sangue que se formava, sem tocar a pele, utilizando cada vez uma parte limpa do papel de filtro. Quando o sangue parava de fluir e de manchar o papel, o cronômetro era parado e esse tempo decorrido era registrado como o TS. Considerou-se TS normal entre 1 e 3 minutos.

Para a realização do tempo de coagulação (TC), foi utilizada a técnica de Lee-White (205). O sangue venoso foi coletado por punção venosa e o cronômetro acionado assim que o sangue aparecesse na seringa. Tomaram-se dois tubos secos e limpos, sem anticoagulante (tubo para hemólise), e colocado 1 mL de sangue em cada um. A seguir, os tubos eram colocados em banho-maria, a 37°C. Inclinava-se um dos tubos a cada minuto, até que este pudesse ser inclinado em um ângulo de 90°, sem que o sangue escorresse. Inclinava-se então o segundo tubo de 30 em 30 segundos até à formação do coágulo. O tempo entre o momento da coleta e a total

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coagulação do sangue foi registrado como o TC. Considerou-se TC normal entre 5 e 10 minutos.

A PL foi realizada após a verificação da tensão arterial sistólica (TAS) e da tensão arterial diastólica (TAD) pelo método de Korotkoff, em um dos membros superiores. Foi calculado o valor médio da tensão arterial (TAS+TAD)/2 e o manguito foi novamente insuflado até o valor médio e assim mantido por cinco minutos. A prova foi considerada positiva quando houve o aparecimento de 20 ou mais petéquias, no espaço de 2,5 cm2_{, no membro submetido ao teste.}

De acordo com os critérios de exclusão estabelecidos para o estudo, todos os pacientes tiveram amostra do soro testada para HIV, hepatite B, hepatite C e dengue. Foram realizados os seguintes testes: Anti-HIV Tetra ELISA® _(Biotest®₎

(ensaio imunoenzimático do tipo sanduíche, de terceira geração, para detecção de anticorpos IgG contra duas proteínas recombinantes do HIV - gp41 e p24 - e dois peptídios provenientes das regiões GAG/ENV do HIV-1 e HIV-2); ELISA Anti-HBc total (DiaSorin®_{) (ensaio imunoenzimático para detecção de anticorpos totais contra}

HBcAg recombinante) e ELISA HBsAg (DiaSorin®_{) (ensaio imunoenzimático do tipo}

sanduíche para detecção do HBsAg); ELISA Anti-HCV (DiaSorin®_{) (ensaio}

imunoenzimático para detecção de anticorpos totais contra polipeptídios recombinantes das regiões estrutural e não-estrutural do HCV); MAC-ELISA anti- dengue (ensaio imunoenzimático para detecção de anticorpos IgM contra pool de DEN-1, DEN-2 e DEN-3). A detecção de HBsAg só foi realizada nos pacientes positivos para anti-HBc total. Adotou-se como critério de exclusão a positividade

para HBsAg, por estar a presença deste antígeno associada às formas clínicas que podem cursar com plaquetopenia, p. ex., estado de portador crônico e hepatite crônica.

O teste para HIV foi realizado no Laboratório de Análises Clínicas da FMT- AM e os testes para HBV, HCV e dengue foram realizados na Gerência de Virologia da FMT-AM.