EXPECTATIVAS DE TRATAMENTO E MELHORA DA QUALIDADE DE VIDA

A terapia atual para DPOC tem melhorado o manejo desta doença difícil, mas ainda há uma necessidade premente de novas abordagens terapêuticas, especialmente na redução da progressão e mortalidade desta doença. DPOC tornou-se uma fuga muito maior dos recursos para a saúde do que a asma, e ultrapassa as despesas de saúde sobre asma por cerca de três vezes nos países industrializados. Como a prevalência da DPOC é previsto para aumentar em todo o mundo durante os próximos 20 anos vai escalar esses custos adicionais.

Não há dúvida de que a gestão da DPOC tem melhorado consideravelmente com a introdução de tratamentos mais eficazes e a utilização de intervenções não-farmacológicas, como reabilitação pulmonar e ventilação não invasiva (RENNARD, 2004; SUTHERLAND;

CHERNIACK, 2004). Há várias novas terapias atualmente em desenvolvimento para a DPOC, que são orientados sobre o processo inflamatório crônico (BARNES, 2002; BARNES;

HANSEL, 2004).

O tabagismo é a principal causa da DPOC no mundo e cessação do tabagismo é a única intervenção terapêutica que até agora demonstrou reduzir a progressão da doença (SCANLON, et al, 2000). Orientações para DPOC recomendam agora o uso de broncodilatadores de ação prolongada como o pilar da gestão de DPOC. A introdução dos b2-agonistas, formoterol, salmeterol e do brometo de tiotrópio, anticolinérgicos, têm sido importantes avanços no tratamento da DPOC (SIN et al, 2003; TASHKIN; COOPER, 2004).

O local de corticosteróides no tratamento da DPOC permanece incerto. Altas doses de corticóides sistêmicos (via oral ou intravenosa) fornecem um benefício modesto na redução da permanência hospitalar e nos tempo até a próxima exacerbação e estão, portanto, rotineiramente utilizado na gestão das internações hospitalares (NIEWOEHNER, 2002). Eles

também são úteis na redução da taxa de re-admissão quando administrado a ambulatorial após tratamento de emergência (AARON et al, 2003). No entanto, em geral, os corticosteróides não devem ser administrados por mais de 2 semanas por causa de efeitos adversos.

Vários estudos randomizados de grande escala, têm demonstrado que a reabilitação pulmonar melhora o desempenho do exercício e estado de saúde em pacientes com DPOC (LACASSE et al, 2002).

A magnitude desses efeitos é muitas vezes maior do que as observadas com a maioria dos broncodilatadores. A reabilitação pulmonar também reduz a utilização dos recursos de saúde.

Permanece incerto se a reabilitação pulmonar afeta a freqüência de exacerbações, a progressão da doença ou mortalidade.

É claro que a atual terapia da DPOC está longe do ideal e que as terapias melhoradas são necessárias. Há várias abordagens para a descoberta de novas terapias, mas mais pesquisa anormalidades na base celular, molecular e genética da DPOC são necessários, bem como as melhores maneiras de pacientes fenótipo e identificar biomarcadores úteis da doença (BARNES; HANSEL, 2004).

7 METODOLOGIA

 ASPECTOS ÉTICOS

Os animais foram manipulados segundo padrões estabelecidos pelo os Princípios Éticos na Experimentação Animal, adotado pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade do Vale do Paraíba – UNIVAP (Protocolo nº A013CEP/2009) e pelo Comitê de Ética e Pesquisa com Animais da Faculdade Santo Agostinho (Protocolo n° 190/09).

 TIPOS DE PESQUISA

Estudo de caráter experimental, descritivo, e qualitativo.

 DELIMITAÇÃO DO UNIVERSO

Grupos de ratos (Rattus novergicus, linhagem Wistar) machos (12 – 15 semanas; 250 – 300 g) adquiridos no Biotério Central da Faculdade Santo Agostinho – FSA (Teresina - PI).

Os animais foram selecionados de forma aleatória; após quarentena (sete dias) foram acondicionados em gaiolas e mantidos em um ciclo de 12 h claro/escuro com livre acesso a água e ração padrão.

 APARELHOS

Utilizou-se laser semicondutor de baixa intensidade da marca BIOSET® modelo PHYSIOLUX DUAL, diodo Índio Gálio Alumínio Fósforo (InGaAlP) com potência de 30mW e comprimento de onda de 670 nanômetros irradiando uma área de 0.785 cm² cada ponto com densidade de energia de 7 J/cm². Conforme os autores (MATERA;

TATARUNAS; OLIVEIRA, 2003; RAMEY; BASFORD, 2000; KOLARI, 1985), quanto maior o comprimento de onda maior a profundidade atingida, podendo o laser 670nm penetrar em um tecido cerca de 0,5 a 1,5 cm, afirmam ainda que o laser diodo tem maior penetração do que o laser de Hélio Neônio.

Figura 4: Aparelho e caneta LASER.

Fonte: Laboratório de Eletrotermofototerapia da FSA

 GRUPOS EXPERIMENTAIS

Os ratos foram divididos em três grupos sendo cada grupo constituído por dez animais (n

= 10), organizados da seguinte forma: grupo controle (GC); grupo DPOC (GD); grupo DPOC + laser (GL). No grupo controle, os animais foram expostos apenas às condições de ar ambiente; no grupo DPOC, os animais foram expostos à fumaça de cigarro por inalação passiva; no grupo DPOC + laser, os animais foram expostos à fumaça de cigarro por inalação passiva e tratados com laser após o estabelecimento da inflamação pulmonar.

 INDUÇÃO DA INFLAMAÇÃO

A indução da resposta inflamatória pulmonar se deu através da inalação de fumaça de cigarro comercial (alcatrão 13,0 mg, nicotina 1,10 mg, monóxido de carbono 10 mg), onde os animais foram fumantes passivos, inalando a fumaça de 14 (quatorze) cigarros por dia para cada dupla, sete sessões diárias de 10 minutos, 06 (seis) dias por semana, durante 45 dias, com intervalos de 15 (quinze) minutos entre um cigarro e outro. Em outros trabalhos a inflamação pulmonar pode ser confirmada com 10, 20, 30, 60 dias e seis meses de inalação de fumaça de cigarro (DHAMI et al, 2000; LAGENTE et al, 2005; D'HULST et al, 2005;

SHAPIRO et al, 2003).

Os animais eram colocados em dupla em uma caixa de madeira com as seguintes medidas:

40 cm x 30 cm e 25 cm de altura (VALENÇA ; PORTO, 2008). Algumas modificações em relação à câmara de Valença e Porto, a caixa sendo dotada de quatro orifícios na tampa, um em cada lateral de 30 cm, onde eram acoplados os cigarros, totalizando seis orifícios e uma proteção com tela em náilon para os animais não terem contato físico com o cigarro. O tempo de 10 minutos foi o observado, pela equipe de pesquisa, de queima do cigarro no ambiente da caixa. Aos 43 dias de aplicação de fumaça de cigarro, dois animais do GD morreram após a terceira sessão diária de inalação, talvez por conseqüência da inflamação já estabelecida.

Figura 5 - Câmara para inalação do cigarro

Fonte: Laboratório de Fisiologia da Faculdade Santo Agostinho, 2010.

 PROTOCOLO DE TRATAMENTO

Após os 45 dias de exposição à fumaça de cigarro, os ratos do GL foram submetidos à LBP durante 15 dias. A aplicação foi pontual em três regiões na face frontal, um na região da carina e outros dois no centro de cada hemitórax, com um tempo de 21s em cada ponto (calculado pelo próprio aparelho), totalizando 63s de exposição uma vez ao dia. Conforme Agne (2005), o tempo de exposição é calculado com a multiplicação da densidade (J/cm²) pela área (cm²), dividida pela potência de emissão (W), e ainda o mesmo autor cita que ao irradiar o organismo, a energia deve ser medida e calibrada para não sobrecarregar ou não ser ineficiente no meio vivo. Esse procedimento é automático hoje nos aparelhos modernos através de seletores de densidade de potência, desde que seja fornecida a dose indicada.

Antes da aplicação da LBP foi realizada a tricotomia na região torácica. Aos 43 dias de aplicação de fumaça de cigarro, dois animais do GD morreram após a terceira sessão diária de inalação, talvez por conseqüência da inflamação já estabelecida.

Figura 6: Tricotomia da região torácica.

Fonte: Laboratório de Fisiologia da Faculdade Santo Agostinho, 2010.

A B C

Figura 7: Pontos de aplicação da LBP (A- carina, B- hemitórax esquerdo, C- hemitórax direito).

Fonte: Laboratório de Fisiologia da Faculdade Santo Agostinho, 2010.

 EUTANÁSIA

Todos os animais foram sacrificados no mesmo dia com hiperdosagem de anestésico (tiopental 300mg/Kg) para a retirada do pulmão.

 AVALIAÇÃO DO LAVADO BRONCOALVEOLAR

Para a realização do LBA foram selecionados cinco animais de cada grupo, onde estes foram anestesiados com ketamina (100mg/Kg) e xilazina (20mg/Kg), e a seguir foi feita uma incisão longitudinal na região cervico-ventral, assim a traquéia exposta e canulada. Foi acoplada a uma das entradas uma cânula; a uma segunda entrada, uma seringa contendo 20 ml de PBS que foi ejetada no pulmão, aplicada uma massagem local e depois aspirados 10 ml de secreção pulmonar. O LBA obtido foi centrifugado, por 10 minutos a 1500 rpm. O sobrenadante foi desprezado e o botão celular ressuspenso em 1 ml de PBS. Com este botão fez-se o esfregaço que foi corado com o método May Grünwald – Giensa e as lâminas preparadas para a contagem das células totais realizada em câmara de Neubauer.

Figura 8: Realização do lavado broncoalveolar.

Fonte: Laboratório de Fisiologia da Faculdade Santo Agostinho, 2010.

 AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA

Para a avaliação histológica, reservou-se o pulmão direito dos cinco animais restantes de cada grupo que foram conservados em formol à 10% para, então, serem realizados os cortes de parênquima pulmonar após aplicação em parafina, com espessura de 5μm e corados com hematoxilina e eosina (HE) (FUSCO et al, 2002) e resorcina-fucsina, utilizando o kit comercial resorcina-fucsina de weigert Easypath para análise de fibras elásticas, sendo analisado ainda a morfologia do parênquima pulmonar (FUSCO et al 2002). Após a preparação das lâminas, foi realizada uma análise histopatológica qualitativa, visual com auxílio de microscópio óptico, realizado por um patologista. A imagem das lâminas foi obtida a partir de microscópio óptico comum, binocular, acoplado a uma câmera com captura de imagens, modelo TA-0124 XS, com resolução de 1.3 mega pixel, do laboratório de Biologia Geral do Colégio São Francisco de Sales – Diocesano.

 MÉTODOS DE QUANTIFICAÇÃO DOS MEDIADORES INFLAMATÓRIOS

Real Time-PCR - A expressão de RNAm no tecido pulmonar de animais submetidos ou não a I/R-i foi quantificada através da técnica de RT-PCR para os seguintes mediadores pró-inflamatórios: MMP-9 e MMP-12. Os ensaios foram conduzidos seguindo as especificações do fabricante. Para tanto, 1 µg do RNA total foi usado para a síntese do cDNA a para a análise da expressão do gene através do RT-PCR. Inicialmente, o DNA contaminado foi removido usando a DNase I (Invitrogen) na concentração de 1 unidade/μg de RNA na presença de 20mM Tris-HCl (pH 8.4), contendo 2 mM MgCl2 durante 15 minutos a 37°C.

Após essa etapa, esse material foi incubado a 95°C durante 5 minutos para a inativação da enzima. A transcrição reversa (RT) foi realizada em uma solução com 200 μl na presença de 50mM Tris-HCl (pH 8.3), 3 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol, 0.5 mM de dNTPs e 50 ng of primers randomizados com 200 unidades de transcriptase reversa (Invitrogen). As condições para essa reação foram as seguintes: 20°C durante 10 minutos, 42°C durante 45 minutos e 95°C durante 5 minutos. O produto da reação foi amplificado através do real time PCR em um sistema de detecção de 7000 sequências (ABI Prism, Applied Biosystems, Foster City, CA) usando um kit SYBRGreen para reação (Applied Biosystems). As condições para ciclagem termal foram as seguintes: 50ºC durante 2 minutos, 95ºC durante 10 minutos, e a partir daí, 40 ciclos a 95°C durante 15 segundos e 60°C durante 1 minuto. Os experimentos foram realizados em triplicatas para cada ponto. A presença de RNAm para 9 e MMP-12 foi quantificada como um valor relativo comparado com uma referência interna, a qual a concentração não varia durante as diversas condições experimentais. Os valores quantitativos para as moléculsa mencionadas acima e para a transcrição do RNAm para a GAPDH foram obtidos a partir da curva do número de ciclos, no qual o aumento sinal associado com o crescimento exponencial dos produtos começam a ser detectados. As curvas de Melting foram construídas no final de cada ciclo no sentido de garantir a uniformidade do produto. O nível de expressão do gene de cada proteína foi normalizado com base na expressão de GAPDH, utilizado como controle do RNA endógeno. Os valores de ΔCt de cada amostra foram determinados pela subtração da media do valor de Ct do RNAm para MMP-9 e MMP-12 da média do valor de Ct da GAPDH, usado como controle interno. Dessa forma, o parâmetro de 2 ^ΔCt foi usado para expressar a expressão relativa do RNAm.

ELISA (Enzyme linked imunnoasorbance assay) - O método utilizado se baseia na interação anticorpo-antígeno. Foi usada uma placa de superfície inerte com poços onde foram absorvidos os antigenos de interesse juntamente com um tampão de carbonato-sensibilização.

Após essa fase realizou-se uma lavagem com PBS. Posteriormente feito o bloqueio com PBS Tween com 10% de BSA para que esta ocupasse os poços livres. A superfície então tratada com solução de anticorpo primário - sabendo-se que existe uma quantidade maior de anticorpo do que proteína - específico para a proteína de interesse, e este vai se ligar a ela. A superfície foi lavada novamente para retirar os anticorpos primários que não foram incorporados em nenhuma proteína. Em seguida o produto foi tratado com anticorpos secundários que possuem uma enzima acoplada para produzir uma substância corada e que se constitui de um anticorpo para o anticorpo primário. A superfície foi lavada novamente para a retirada do anticorpo secundário que não se ligou ao anticorpo primário. Adicionou-se o substrato de ligação para a enzima produzir a substância corada e, assim, medindo-se a intensidade da cor da superfície, pode-se quantificar e verificar a presença de alguma substância de interesse. Os mediadores inflamatórios no tecido pulmonar analisados através do ELISA foram: TNF-α , MIP-12 e IL-1β, através de seus respectivos kits.

 AVALIAÇÃO ESTATÍSTICA

Os resultados do LBA e do teste ELISA foram submetidos à análise de variância (ANOVA), expressos como a média  erro padrão da média (EPM). Valores de p < 0,05 sendo considerados significativos e p < 0,001 sendo considerados altamente significativos.

8 RESULTADO E DISCUSSÃO

Vários estudos sobre o tabagismo apontam que no Brasil e no mundo há uma grande tendência de jovens se envolverem com o uso do tabaco, o que pode levar a uma pandemia silenciosa e que provoque grandes prejuízos aos cofres públicos e a própria saúde humana, pois o cigarro apresenta mais de 4700 substâncias tóxicas que podem levar a uma série de injúrias, principalmente as respiratórias e do tipo DPOC (ANDRADE et al, 2006; PINTO ; RIBEIRO, 2007; STRAMARI et al, 2009). Estes jovens começam a fumar por volta dos 14 anos e quando chegam à fase adulta já apresentam um longo período de inalação de fumaças tóxicas, que está ligado a uma série de fatores, inclusive ao uso de bebidas alcoólicas (STRAMARI et al, 2009), levando a crer na existência de outra parcela de indivíduos que não fumam, mas que se expõem a inalação passiva da queima de cigarros.

A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é caracterizada como uma doença infla-matória das vias respiratórias, do parênquima e dos vasos pulmonares, evoluindo com lenta, progressiva e irreversível obstrução ao fluxo expiratório, secundária à bronquite crônica ou ao enfisema pulmonar (GOLD, 2005).

Rufino et al (2007) propõe que a inflamação relacionada ao fumo tenha duas etapas: a inicial, que aconteceria no epitélio e na submucosa, com participação de neutrófilos e de macrófagos; e a tardia, com a participação adicional dos linfócitos.

Estudos com modelos animais, em especial ratos ou camundongos mostram que a exposição à fumaça de cigarros de forma passiva, por menor tempo possível já é capaz de ativar células inflamatórias e mediadores que podem levar a inflamações pulmonares relacionadas ao enfisema (SHAPIRO, 2000; VALENÇA; PORTO, 2008). Esta inflamação é caracterizada pela presença de macrófagos, neutrófilos, linfócitos CD8+, associada à alteração do número de fibras colágenas e elásticas e o aumento do diâmetro dos alvéolos pulmonares, aumentando o espaço morto fisiológico, diminuindo a capacidade respiratória dos indivíduos (TARANTINO, 2008). Este processo tem a participação de substâncias químicas, como os mediadores TNF-α, TGF-β, IL-1β e outros que promovem uma cadeia inflamatória degradando o parênquima pulmonar ou aumentando a secreção nesta área, provocando a injúria respiratória (BARBES ; STOCKLEY, 2005; CHUNG ; ADCOCK, 2008).

Corroborando com estes dados, esta pesquisa com ratos Wistar que inalaram durante 45 dias fumaça de 14 cigarros por dia, também mostra os mesmos resultados em termos de células e presença de mediadores inflamatórios do grupo das citocinas e quimiocinas. E ao

mesmo tempo mostra um efeito antiinflamatório do laser de baixa potência que foi utilizado como mecanismo de tratamento não medicamentoso e não invasivo, pois após o período de inalação, os animais tratados por 15 dias, com uma aplicação diária de laser em três pontos, uma a nível de carina, e outra em cada hemitórax, promoveu uma redução considerável nas células do tipo neutrófilos no LBA e nos mediadores testados pelo ELISA, como mostra nos gráficos abaixo .

O LBA é mais confiável para quantificar a abundância de neutrófilos, pois estas células migram diretamente dos capilares para o espaço alveolar, mas menos confiáveis para avaliar a abundância de macrófagos, uma vez que muitos macrófagos permanecer no espaço intersticial (SHAPIRO et al., 2003).

Dados do lavado broncoalveolar (gráfico 1) demonstraram um aumento altamente significativo (p < 0,001) no número de neutrófilos no grupo DPOC quando comparado ao grupo controle. Resultados semelhantes foram encontrados por Shapiro et al (2003) ao realizar um estudo utilizando 26 camundongos com deficiência da elastase neutrofílica (NE-), 20 com presença de elastase neutrofílica (NE+) da linhagem do tipo selvagem, 12 com elastase macrofágica (MMP12) e 24 que não foram expostos a fumaça de cigarro. Os camundongos NE-, NE+ e MMP12 foram submetidos a 2 cigarros sem filtro por dia, seis dias por semana, durante seis meses. Através de avaliação feita pelo LBA observou-se que os camundongos da linhagem do tipo selvagem (NE+) tiveram um aumento 5 vezes maior no número de neutrófilos quando comparados com os camundongos NE- expostos a fumaça de cigarro; com relação aos macrófagos, os números de linha de base não foram afetados pela falta genética de NE.

Gráfico 1 - Neutrófilos no Lavado Broncoalveolar. Mostra a diminuição de neutrófilos no grupo tratado com laser em relação ao grupo DPOC, e ao mesmo tempo mostra a existência da inflamação com o aumento de neutrófilos do grupo DPOC em relação ao controle.

O gráfico acima representa a contagem de neutrófilos do lavado broncoalveolar em ratos dos três grupos participantes da pesquisa, e verifica-se que em relação ao controle, o número destas células é bem mais abundante no DPOC, representando 350 x 10⁵, o que indica a presença de inflamação e no grupo tratado com laser esse valor reduz para cerca de 180 x 10⁵, o que mostra que o laser exerceu função anti-inflamatória proporcionando a redução destas células, pois entre os grupos DPOC e DPOC + laser a redução foi significativa (p < 0,05) que de acordo com Tarantino (2008), são as mais encontradas no LBA de pacientes com DPOC, e como mostra Rufino et al (2006) em seus trabalhos, ocorre um aumento considerável destas células em contagem de células do escarro em pacientes com DPOC em relação aos indivíduos tabagistas sem DPOC e não tabagistas.

Os neutrófilos, uma das principais células presentes na inflamação pulmonar, são responsáveis pela produção de serinas proteases, que são enzimas proteolíticas neutrofílicas que apresentam vários atividades, como a degradação de fibras elásticas no tecido pulmonar, sendo uma das poucas enzimas humanas com essa capacidade (SERRA, et al, 2008). D'Hulst et al. (2005), utilizou grupos de 8 camundongos expostos à fumaça de tabaco de 5 cigarros quatro vezes por dia, com intervalos de 30 minutos livres de fumo, 5 dias por semana, durante 5 e 24 semana (1 e 6 meses). Intencionando verificar os efeitos agudos e crônicos da inalação de fumaça de cigarro. Verificou ao fim do seu estudo que nos animais com inflamação subaguda (1 mês) houve um aumento significativo de neutrófilos, macrófagos e células dendríticas no LBA, por outro lado, a exposição crônica a fumaça de cigarro induziu um aumento ainda maior no número de neutrófilos, macrófagos e células dendríticas, células T CD4 + e CD8 + e linfócitos T em camundongos. Outros autores verificaram em tabagistas, os neutrófilos estão aumentados no escarro e no lavado broncoalveolar.

Os neutrófilos estão presentes juntamente com o mediador inflamatório TNF-α, que como mostra o gráfico 2 também mostra-se abundante no grupo DPOC e acompanha a queda de neutrófilos no GL, tratado com laser 670nm. Estas células estão implicadas na liberação de citocinas inflamatórias, mediadores lipídicos e enzimas capazes de promover dano tecidual (HOLZ, et al, 2008); além disso, podem promover hipersecreção de muco e proliferação de glândulas mucosas (COSTA et al, 2009). O TNF-α é produzido por macrófagos e ou células do epitélio respiratório que proporciona uma comunicação celular por meio de sinais químicos. Este mediador é uma substância da categoria das monocinas e sua secreção pelos macrófagos pode ser ativada por vários estímulos, exercendo atividades como a proliferação, diferenciação e apoptose celular, o que provoca no caso da DPOC, a destruição do parênquima. Esta molécula também estimula a liberação de colagenases e aumenta a

expressão de moléculas de adesão, que também são encontradas na DPOC, provocando o extravasamento leucocitário que atrai neutrófilos, que embora apresentem um menor diâmetro em relação aos poros do capilar sanguíneo pulmonar, conseguem sair e atuar na parede pulmonar provocando inflamação, especialmente na DPOC grave (RUFINO; SILVA, 2006).

expressão de moléculas de adesão, que também são encontradas na DPOC, provocando o extravasamento leucocitário que atrai neutrófilos, que embora apresentem um menor diâmetro em relação aos poros do capilar sanguíneo pulmonar, conseguem sair e atuar na parede pulmonar provocando inflamação, especialmente na DPOC grave (RUFINO; SILVA, 2006).