4.4.1 Ativação partenogenética de ovócitos bovinos
Após o período de maturação in vitro, os ovócitos foram desnudados, selecionados quanto ao citoplasma homogêneo e divididos entre os grupos de ativação partenogenética (Figura 11):
Grupo Ionomicina + Cicloheximide com baixo cálcio:
Incubados em meio MEM hepes + 10% SFB + 5µM ionomicina (Sigma, I0634) por 8 minutos, lavados em MEM hepes+ 10% SFB e incubados em meio MEM + 10% SFB + 10µg/ml cicloheximide (Sigma, C1988) + 5 µg/ml citocalasina B (Calbiochem, 250233) por 4 horas.
Grupo Ionomicina + Roscovitine com baixo cálcio:
Incubados em meio MEM hepes + 10% SFB + 5µM ionomicina por 8 minutos, lavados em MEM hepes + 10% SFB e incubados em meio MEM + 10% SFB + 66µM roscovitine + 5 µg/ml citocalasina B por 5 horas.
Grupo Ionomicina + Estrôncio com baixo cálcio:
Incubados em meio MEM hepes + 10% SFB + 5µM ionomicina por 8 minutos, lavados em MEM hepes + 10% SFB e incubados em meio MEM + 10% SFB + 20mM cloreto de estrôncio (J T Baker, 4036-01) + 5 µg/ml citocalasina B por 5 horas.
Grupo Ionomicina + 6 DMAP com baixo cálcio:
Incubados em meio MEM hepes + 10% SFB + 5µM ionomicina por 8 minutos, lavados em MEM hepes + 10% SFB e incubados em meio MEM + 10% SFB + 2mM 6 DMAP (Sigma, D2629) + 5 µg/ml citocalasina B por 4 horas.
Grupo Ionomicina + Cicloheximide com alto Cálcio:
Incubados em meio MEM hepes + 0,84mg/ml CaCl2 (Sigma, C7902) + 10%
SFB + 5µM ionomicina por 8 minutos, lavados em MEM hepes + 10% SFB e incubados em meio MEM + 0,42mg/ml CaCl2 + 10% SFB + 10µg/ml
cicloheximide + 5 µg/ml citocalasina B por 4 horas.
Grupo Ionomicina + Roscovitine com alto Cálcio:
Incubados em meio MEM hepes + 0,84mg/ml CaCl2 + 10% SFB + 5µM
ionomicina por 8 minutos, lavados em MEM hepes + 10% SFB e incubados em meio MEM + 0,42mg/ml CaCl2 + 10% SFB + 66µM roscovitine + 5 µg/ml
citocalasina B por 5 horas.
Grupo Ionomicina + Estrôncio com alto Cálcio:
Incubados em meio MEM hepes + 0,84mg/ml CaCl2 + 10% SFB + 5µM
ionomicina por 8 minutos, lavados em MEM hepes + 10% SFB e incubados em meio MEM + 0,42mg/ml CaCl2 + 10% SFB + 20mM cloreto de estrôncio + 5
µg/ml citocalasina B por 5 horas.
Grupo Ionomicina + 6 DMAP com alto Cálcio:
Incubados em meio MEM hepes + 0,84mg/ml CaCl2 + 10% SFB + 5µM
ionomicina por 8 minutos, lavados em MEM hepes + 10% SFB e incubados em meio MEM + 0,42mg/ml CaCl2 + 10% SFB + 2mM 6 DMAP+ 5 µg/ml
citocalasina B por 4 horas.
Após o período de ativação os ovócitos foram cultivados (10µl de meio para cada ovócito) em meio HTF:BME (1:1), 0,6% BSA + 10% SFB + 0,01% mioinositol (Sigma, I5125) + 75µg/ml gentamicina à 39oC em atmosfera com 5% de CO2, 5% de O2, e 90% de N2 por 24 horas.
FIGURA 11 - Distribuição dos ovócitos bovinos nos grupos experimentais de ativação partenogenética para 24 horas de cultivo (I: ionomicina; C: cicloheximide; R: roscovitine; E: estrôncio; 6D: 6 DMAP).
A avaliação das taxas de ativação foi realizada por meio da transferência dos ovócitos, após o período de cultivo, para gotas de 10µl de Hoescht 33342 (7,5 µg/ml) em lâmina histológica, cobertos com lamínula e avaliados em microscópio invertido Leica- DMIRB luz UV filtro nº 2 (350 a 461 nm). Foram considerados ativados os ovócitos que apresentaram uma placa metafásica e dois corpúsculos polares, descondensação da cromatina indicando a formação de pró-núcleos, singamia, primeira figura mitótica ou clivados no momento da análise.
4.2.2 Ativação partenogenética de ovócitos eqüinos
Após o período de maturação in vitro, os ovócitos foram desnudados, selecionados quanto ao citoplasma homogêneo e divididos entre os grupos de ativação partenogenética abaixo, respeitando a separação inicial entre ovócitos expandidos e compactos (Figura 12 e 13):
Grupo Ionomicina + Cicloheximide com baixo cálcio:
Incubados em meio MEM hepes+ 10% SFB + 5µM ionomicina por 8 minutos, lavados em MEM hepes+ 10% SFB e incubados em meio MEM + 10% SFB + 10µg/ml cicloheximide + 5 µg/ml citocalasina B por 4 horas.
nº total de ovócitos 665 ↓ Cálcio 357 ↑ Cálcio 308 I + E 98 I + 6D 45 I + R 128 I + C 86 I + E 84 I + 6D 49 I + R 129 I + C 46
Grupo Ionomicina + Roscovitine com baixo cálcio:
Incubados em meio MEM hepes + 10% SFB + 5µM ionomicina por 8 minutos, lavados em MEM hepes + 10% SFB e incubados em meio MEM + 10% SFB + 66µM roscovitine + 5 µg/ml citocalasina B por 5 horas.
Grupo Ionomicina + 6 DMAP com baixo cálcio:
Incubados em meio MEM hepes + 10% SFB + 5µM ionomicina por 8 minutos, lavados em MEM hepes + 10% SFB e incubados em meio MEM + 10% SFB + 2mM 6 DMAP + 5 µg/ml citocalasina B por 4 horas.
Grupo Ionomicina + Cicloheximide com alto Cálcio:
Incubados em meio MEM hepes + 0,84mg/ml CaCl2 + 10% SFB + 5µM
ionomicina por 8 minutos, lavados em MEM hepes + 10% SFB e incubados em meio MEM + 0,42mg/ml CaCl2 + 10% SFB + 10µg/ml cicloheximide + 5 µg/ml
citocalasina B por 4 horas.
Grupo Ionomicina + Roscovitine com alto Cálcio:
Incubados em meio MEM hepes + 0,84mg/ml CaCl2 + 10% SFB + 5µM
ionomicina por 8 minutos, lavados em MEM hepes + 10% SFB e incubados em meio MEM + 0,42mg/ml CaCl2 + 10% SFB + 66µM roscovitine + 5 µg/ml
citocalasina B por 5 horas.
Grupo Ionomicina + 6 DMAP com alto Cálcio:
Incubados em meio MEM hepes + 0,84mg/ml CaCl2 + 10% SFB + 5µM
ionomicina por 8 minutos, lavados em MEM hepes + 10% SFB e incubados em meio MEM + 0,42mg/ml CaCl2 + 10% SFB + 2mM 6 DMAP+ 5 µg/ml
citocalasina B por 4 horas.
Após o período de ativação os ovócitos foram cultivados (10µl de meio para cada ovócito) em meio DMEM/F12 (Gibco 11320-033) + 10% SFB + 0,01% mioinositol + 75µg/ml gentamicina à 39oC em atmosfera com 5% de CO2, 5% de O2, e 90% de N2 por 24 horas ou até o dia 3 após ativação.
FIGURA 12 - Distribuição dos ovócitos eqüinos nos grupos experimentais de ativação partenogenética em 24 horas de cultivo (I: ionomicina; C: cicloheximide; R: roscovitine; 6D: 6 DMAP).
FIGURA 13 - Distribuição dos ovócitos eqüinos nos grupos experimentais de ativação partenogenética em três dias de cultivo (I: ionomicina; C: cicloheximide; R: roscovitine; 6D: 6 DMAP).
A avaliação das taxas de ativação foi realizada por meio da transferência dos ovócitos, após o período de cultivo, para gotas de 10µl de Hoescht 33342 (7,5 µg/ml) em lâmina histológica, cobertos com lamínula e avaliados em microscópio invertido Leica- DMIRB luz UV filtro nº 2 (350 a 461 nm). Foram considerados ativados os ovócitos que apresentaram uma placa metafásica e dois corpúsculos polares, descondensação da cromatina indicando a formação de pró-nucleos, singamia, primeira figura mitótica ou clivados no momento da análise. nº total de ovócitos 445 Expandidos 248 Compactos 197 ↓ Cálcio 128 ↑ Cálcio 120 ↓ Cálcio 100 ↑ Cálcio 97 I + R 47 I + 6D 39 I + R 41 I + 6D 36 I + C 43 I + R 31 I + 6D 43 I + C 26 nº total de ovócitos 460 Expandidos 259 Compactos 201 ↓ Cálcio 133 ↑ Cálcio 126 ↓ Cálcio 100 ↑ Cálcio 101 I + R 50 I + 6D 38 I + R 43 I + 6D 37 I + C 46 I + R 32 I + 6D 45 I + C 23 I + C 45 I + R 30 I + 6D 45 I + C 26 I + C 42 I + R 29 I + 6D 43 I + C 25