Experimento III: Temperatura dos animais tratados com LPS *

nenhum ponto do grupo CTR+Ac (Figura 11).

36,4 36,6 36,8 37,0 37,2 37,4 37,6 37,8 38,0 38,2 Basal 2h 24h 26h 48h 50h 72h 74h 96h CTR+Veículo CTR+Ac PS+Veículo PS+Ac

Figura 11 – Efeito do anticorpo anti-IL-1 na temperatura corpórea (ºC) de ratos privados de sono durante 96 horas. Os animais PS e do grupo CTR foram tratados diariamente com 2µg/Kg de anticorpo

anti-IL-1 (n=12 e n=10, respectivamente) ou veículo (n=12 e n=10, respectivamente) via intraperitoneal (i.p.). A temperatura dos animais foi mensurada 2 horas e 24 horas após cada administração, durante 96 horas. Valores representados por média ± e.p. * PS+Vei difere do próprio basal (p 0,00003) ; ¥ PS+Ac difere do próprio basal (p= 0,0003);

¤

Cada ponto do eixo das abscissas (eixo X), refere-se à uma medição realizada em um dado momento, representada na escala de maneira não proporcional.

5.3 Experimento III: Temperatura dos animais tratados com LPS

*

¤

A Figura 12 mostra o efeito do tratamento com LPS na temperatura corpórea de cada grupo e a Figura 13 mostra o perfil da temperatura dos animais que receberam LPS ao longo do tempo.

A ANOVA de duas vias revelou que houve efeito significativo do fator grupo [F(2,32)=8,8; p=0,0009], do fator tempo [F(6,192)= 30,4; p<0,0001] e também da interação entre esses fatores [F(12,192)=4,8; p<0,0001]. O teste a posteriori de Tukey mostrou, que a média da temperatura do grupo LPS que recebeu anticorpo (LPS+Ac) é significantemente menor do que a média do grupo LPS que recebeu veículo (LPS+Vei) (p=0,005) e do grupo controle (Vei+Vei) (p=0,002). O grupo Controle, no entanto, não difere em nenhum ponto da sua própria curva de temperatura dentro das 6 horas de mensuração. A análise post-hoc também mostrou que na 3ª hora de medição de temperatura após a administração das drogas, o grupo LPS+Vei diferiu da sua medição realizada na 1ª hora, apresentando temperatura significativamente mais alta (p=0,007). A partir da 4ª hora a temperatura já diferiu também da sua medida basal (p=0,00004) e das mensurações realizadas na 1ª (p=0,00004) e na 2ª hora (p=0,0006). O grupo LPS+Ac apresentou diferença de temperatura significativa na 3ª e 4ª hora em relação à sua medida 1 hora (p<0,006) e 2 horas (p<0,04) após a administração das drogas. No entanto, o grupo LPS+Ac só diferiu de sua medida basal a partir da 5ª hora de medição (p=0,00007), quando diferiu também dos pontos 1 e 2 horas (p<0,00004), tendendo a diferir da 3 hora (p=0,06). Na 6ª hora a temperatura diferiu significativamente da temperatura basal (p=0,00004) bem como das medidas realizadas à 1 hora e às 2 (p=0,00004) , 3 (p=0,004) e 4 horas (p=0,01). Além disso, o grupo LPS+Ac difere do grupo Controle na 1ª hora após a administração das drogas (p=0,03).

É importante ressaltar que todos os grupos partem de temperaturas semelhantes (medida basal sem diferença estatística).

36,8 36,9 37 37,1 37,2 37,3 37,4 37,5 37,6 37,7 Grupos T em p er at u ra (° C ) Vei+Vei LPS+Vei LPS+Ac 36,00 36,20 36,40 36,60 36,80 37,00 37,20 37,40 37,60 37,80 38,00 38,20 Basal 1h 2h 3h 4h 5h 6h T em p er at u ra (° C ) Vei+Vei LPS+Vei LPS+Ac * ¥ * ¥

Figura 13 – Acompanhamento da temperatura (°C) durante 6 horas dos animais tratados com LPS ou veículo.

Valores representados por média ± e.p.

* LPS+Vei difere do próprio basal (p 0,00004). ¥ - LPS+Ac difere do próprio basal (p 0,00007). # Difere do respectivo ponto no grupo controle (Vei+Vei) (p 0,03).

Figura 12 – Temperatura (°C) dos grupos tratados com LPS ou veículo. Os animais receberam

administração de 100µg/Kg de LPS com subseqüente administração de veículo (n=17) ou anticorpo anti- IL-1 (n=18). Um grupo de animais recebeu duas administrações de veículo apenas (n=10).

Valores representados por média ± e.p.

* Difere do grupo LPS+Vei (p=0,005) e do grupo Vei+Vei (p=0,002).

T em p er at u ra ( °C ) T em p er at u ra ( °C ) #

6. DISCUSSÃO

O presente estudo não só confirmou as observações prévias de que a privação de sono causa um aumento sustentado da temperatura durante as 96 horas de protocolo, como também mostrou que essa hipertermia se origina dentro das duas horas iniciais de PS.

Estudos envolvendo privação de sono total em ratos indicam que nessa condição os animais apresentam elevação da temperatura intraperitoneal (BERGMANNN et al., 1989; OBERMEYER et al., 1991) e hipotalâmica (OBERMEYER et al., 1991; SHAW et al., 1998) e além disso, durante a PS, selecionam ambientes progressivamente mais quentes para dormirem, mesmo com a temperatura corpórea acima da basal, o que indica um aumento no ponto de ajuste da temperatura (set point termorregulatório) (PRETE et al., 1991). Essa resposta é igualmente verificada durante o estado febril (BOULANT, 2000).

Dados obtidos anteriormente pelo nosso grupo mostraram que as 24 horas iniciais de PS pelo método da plataforma única (SEABRA &TUFIK, 1993) ou múltipla (PALMA et al., 2009) parecem críticas na alteração da regulação da temperatura dos ratos. Em concordância com esses dados, o presente trabalho identificou aumento significativo da temperatura logo na 2ª hora de PS, que se mantêm durante as primeiras 24 horas. O acompanhamento da temperatura dentro das 24 horas iniciais de PS, realizado por este estudo, indica uma possível alteração do padrão termorregulatório, com aparente perda do ritmo de temperatura dos animais PS, quando comparado com o perfil de temperatura apresentado pelos animais do grupo controle. Os animais do grupo controle exibiram uma curva de temperatura típica de seu ritmo circadiano, com pico durante a fase escura do ciclo claro-escuro, verificado entre as 22 horas e 20 minutos e 24 horas e 20 minutos, período de maior vigília e atividade locomotora para ratos (FRIEDMAN & WALKER, 1968; TIMO-IARIA et al.,

1970; BENSTAALI et al., 2001). A partir das 02 horas e 20 minutos da fase escura do ciclo, a temperatura novamente é semelhante à temperatura basal e assim permanece até o final do experimento às 14 horas e 20 minutos. Essa diminuição da temperatura corpórea dos animais do grupo CTR, em comparação com os picos de temperatura desse grupo, acompanha o aumento do tempo de sono desses animais, que atinge seu percentual máximo por volta das 10 horas do período claro (ANDERSEN & HOSHINO, 2008).

A aferição de temperatura denominada basal (ponto 0 hora), nos experimentos I e II, mostra que ambos os grupos, CTR e PS, partem de temperaturas semelhantes, ou seja, os experimentos são iniciados com os grupos em condições iguais. Os valores de temperatura considerados normais para ratos variam de 35,8 a 37,6 °C (BIVIN et al., 1979), temperatura verificada em todos os animais no início do experimento, em ambos os grupos. Assim, tanto a temperatura no início do experimento como a replicação da curva de temperatura dos ratos pertencentes ao grupo CTR conforme dados da literatura (FRIEDMAN & WALKER, 1968; BAKER et al., 2005) indicam que esses animais estavam de fato, habituados ao método de medição de temperatura e que as alterações da temperatura não devem ser efeito da manipulação.

Os resultados obtidos neste trabalho mostram também que a administração do anticorpo anti-IL-1 em animais privados de sono não teve a propriedade de reverter ou minimizar o aumento de temperatura verificado, demonstrando que a IL-1 , embora seja um pirógeno clássico, não desempenha papel essencial na hipertermia gerada pela PS. Ao contrário, e assim como esperado, a IL-1 claramente está envolvida na resposta febril induzida pelo LPS.

Sabe-se que a PS é um estímulo para liberação da IL-1 (MOLDOFSKY et al., 1989; MACKIEWICZ et al., 1996; TAISHI et al., 1998; YEHUDA et al., 2009) e a fim de investigar a possível participação dessa interleucina no aumento de temperatura induzido pela privação de sono em ratos, administramos anticorpo anti-IL-1 nesses

animais. No entanto, a temperatura dos animais PS que receberam o anticorpo, não diferiu daquela apresentada pelos animais PS que receberam veículo em nenhum dos pontos analisados, indicando um papel não primordial dessa interleucina na hipertermia investigada.

Muitas das ações biológicas iniciadas pela IL-1 são mediadas pelas interleucinas Fator de necrose tumoral (TNF) e/ou Interleucina-6 (IL-6). Além disso, estudos envolvendo privação de sono e aumento dos níveis das citocinas pró- inflamatórias IL-6 e TNF também já foram relatados (KRUEGER et al., 1998; VGONTZAS et al., 1999; YEHUDA et al., 2009). Embora a IL-1 seja uma citocina pirogênica mais potente do que a IL-6, esta também parece ter participação no aumento de temperatura. Um exemplo disso foi evidenciado por Harden e colaboradores (2008). Após a administração intracerebroventricular (i.c.v.) de baixas doses de IL-1 eles verificaram febre de igual ou maior magnitude e duração do que aquela evidenciada por altas doses de IL-6. Além disso, mostraram que doses não pirogênicas de IL-1 e IL-6, quando administradas conjuntamente, podem induzir febre e a administração de uma dose não pirogênica de IL-1 potencializa o efeito pirogênico da IL-6, mostrando que essas duas interleucinas podem atuar sinergicamente. O efeito sinérgico dessas duas interleucinas também foi mostrado por Olivadoti & Opp (2008). Eles trataram camundongos knockout para IL-6 com IL-1 (i.c.v.) e os animais apresentaram modesto aumento de temperatura quando comparado com seu controle, indicando participação importante da IL-6 para a indução da febre por IL-1 . Embora a IL-1 possa induzir a liberação da IL-6, esta pode ser produzida e liberada por outras vias, mesmo sem a participação da IL-1 . Smith & Klueger (1992) mostraram que, a administração do IL-1ra suprime a febre induzida por LPS, mas não inibe a liberação IL-6. Dessa forma, mesmo tendo administrado anticorpo anti-IL-1 para impedir o efeito biológico da IL-1 , não atuamos na inibição da síntese ou ação da IL-6 e, portanto não podemos garantir que a IL-6

não tenha atuado no aumento de temperatura induzido pela PS, mesmo nos animais que receberam o anticorpo em questão.

Outro fator a ser investigado e discutido em relação ao aumento de temperatura causado pela PS é o estresse. Esse componente é inerente às várias técnicas de privação de sono empregadas na pesquisa básica (BERGMANN et al., 1989; SUCHECKI et al., 1998). A atenuação do estresse na privação de sono paradoxal foi alcançada usando-se múltiplas plataformas em um tanque de privação e mantendo neste ambiente os mesmos indivíduos que conviviam na gaiola-moradia desde a separação materna (grupo social estável) (SUCHECKI & TUFIK, 2000), método utilizado neste trabalho.

É esperado que depois de constante submissão a uma situação estressante, o organismo dispare mecanismos de adaptação a fim de reverter as alterações provenientes do impacto do estresse. Alterações imunológicas notadas com a PS aguda em ratos (24 horas), por exemplo, também são notadas com a indução de estresse agudo por imobilização (6 horas). No entanto, cronicamente, tais alterações só se mantêm nos animais privados de sono (MOCTEZUMA et al., 2007). Do mesmo modo, um aumento de temperatura é notado logo no primeiro dia tanto em animais submetidos ao nado forçado quanto em animais submetidos à PS, mas tal aumento só permanece de forma crônica nesta última condição (SEABRA, 1993). Tais dados corroboram a hipótese de que a privação de sono per se influenciaria alterações fisiológicas, tais como alterações na regulação da temperatura corpórea, mas a participação do estresse deve ser considerada, principalmente dentro das primeiras horas de PS, pois é sabido que o estresse psicológico resulta em aumento agudo da temperatura (OKA et al., 2001).

Embora as concentrações de corticosterona permaneçam acima dos valores basais durante toda a privação de sono pelo método da plataforma múltipla modificado (ANDERSEN et al., 2005; SUCHECKI et al., 1998), sabe-se que os glicocorticóides exercem feedback inibitório sobre o aumento de temperatura induzido por estresse,

assim como na febre induzida por LPS em ratos (OKA et al., 2001). Portanto, a corticosterona possivelmente não está envolvida ou não tem papel fundamental nesse evento.

Há relatos de que a noradrenalina tem participação na hipertermia induzida por estresse e que sua administração no hipotálamo de ratos causa aumento na temperatura corpórea (OKA et al., 2001). Embora seu nível plasmático encontre-se elevado apenas com 96 horas de PS (ANDERSEN et al., 2005), sabe-se que os níveis hipotalâmicos de noradrenalina em ratos submetidos ao estresse por imobilização mostram-se elevados significativamente após 60 minutos do início do estresse, assim como os níveis de atividade da IL-1 no hipotálamo (SHINTANI et al., 1995). Dessa forma, é possível que essa catecolamina desempenhe um papel importante na deflagração do aumento de temperatura, dentro das primeiras duas horas de privação.

A participação dos opióides no aumento de temperatura observado nos animais PS também deve ser considerada, pois há indícios de que o sistema opióide possa ter participação na resposta febril, embora os dados sejam controversos quanto ao envolvimento desse sistema no aumento de temperatura induzido por estresse. Fraga e colaboradores (2008) mostraram que a administração intracerebroventricular (i.c.v.) de um antagonista seletivo para receptor µ opióide reduz a febre induzida pela administração intraperitoneal de 5µg/Kg de LPS em ratos e pela administração i.c.v. de TNF e IL-6. Do mesmo modo, mostraram que o pré-tratamento com o antagonista opióide naloxona (via subcutânea) abole a febre induzida pela mesma dose de LPS. Assim, dada a importância da IL-1 para a indução da febre por LPS, espera-se que o tratamento com esses antagonistas também reduza a febre induzida pela administração da própria IL-1 . No entanto, Fraga e seus colegas (2008) não notaram modificação desta resposta febril a partir dos tratamentos com os antagonistas citados. Esses pesquisadores sugerem recrutamento do sistema opióide pelo LPS e pelas interleucinas TNF e IL-6 para indução da febre, o que não aconteceria com a IL-1 . No presente estudo, como a hipertermia induzida pela PS não parece estar fortemente

relacionada com a IL-1 , o envolvimento do sistema opióide pode ser apontado como um dos alvos a ser estudado, principalmente quanto à interação dos opióides com as citocinas no aumento de temperatura. Brown e seus colegas (1992) realizaram desafio imunológico com doses não pirogênicas de hemácias de carneiros em ratos e privaram esses animais de sono através da manipulação por 2 horas. Observaram então, aumento significativo da temperatura colônica dos ratos, mas tal hipertermia foi reduzida com administração de naloxona. Segundo o grupo, a combinação da privação de sono ao desafio imunológico, configura-se uma situação estressante que poderia induzir a liberação de opióides e assim, consequentemente, o aumento de temperatura, não relacionado com aumento nos níveis da IL-1.

Corroborando os dados da literatura, nosso trabalho mostrou que logo após a administração de 100µg LPS, é notado um período de hipotermia nos animais (ELMQUIST et al., 1996) com posterior aumento gradual da temperatura cujo início é observado 1,5 horas após o tratamento e o pico, entre 3 e 4 horas após (MILLER et al., 1997; CARTMELL et al., 1998; 1999; 2001), quando a temperatura difere significativamente de sua medida basal. De acordo com Cartmell e colaboadores (1998; 2001), tal aumento de temperatura é precedido pelo aumento da IL-1 , observado já com 1 hora após a administração do LPS. A produção dessa interleucina mostra-se importante para geração e manutenção da febre, posto que o tratamento com anticorpo anti- IL-1 ou com o seu antagonista, IL-1ra, suprime (LONG et al., 1990a; SMITH & KLUGER, 1992) ou atenua (CARTMELL et al., 1999) o aumento de temperatura. De fato, a administração de 2µg de anticorpo anti-IL-1 retardou o aumento de temperatura nos animais tratados com LPS, impedindo a febre no pico relatado pela literatura. Quanto à hipotermia observada logo após administração de LPS, a literatura indica que este fenômeno está relacionado com a ação periférica da interleucina TNF circulante (ELMQUIST et al., 1996), já que essa fase hipotérmica pode ser bloqueada com a administração de anticorpo anti-TNF (SAPER, 1998). No presente estudo, a hipotermia foi verificada de forma mais acentuada nos animas

tratados com LPS que receberam anticorpo. Tal fato pode dever-se à interferência do anticorpo sobre a ação da IL-1 , que conseqüentemente pode ter afetado os níveis de produção/liberação da TNF nesses animais, fazendo com que exibissem hipotermia.

Este estudo mostrou que, ao contrário da temperatura dos animais tratados com LPS e anticorpo, a temperatura dos animais PS não sofreu alteração com a administração do anticorpo anti-IL-1 , apresentando temperaturas semelhantes àquelas verificadas nos animais PS que receberam veículo. Tal fato indica que o mecanismo subjacente ao aumento de temperatura induzido pela PS pode ter natureza diferente daquele induzido pelo LPS, envolvendo prioritariamente outros mediadores que não a IL-1 . Além disso, o aumento de temperatura induzido pela PS se dá mais rapidamente do que a febre induzida por LPS, diferindo de sua medida basal dentro das primeiras duas horas de PS, enquanto que a temperatura dos animais tratados com LPS só difere da basal 4 horas após o tratamento. O fato do aumento significativo de temperatura gerado pela PS ser anterior ao pico de temperatura induzido pelo LPS pode significar apenas uma diferença temporal na ativação dos mecanismos de aumento de temperatura, mas também pode sugerir a existência de mecanismos distintos para o disparo de ambos.

Embora não tenhamos avaliado estatisticamente, a hipertermia induzida pela PS aparentemente tem maior magnitude do que aquela gerada pela administração de 100 µg/Kg de LPS, em pelo menos 1°C.

O presente estudo fornece evidencias de que a IL-1 não desempenha papel primordial na hipertermia induzida pela privação de sono, ao contrário da febre induzida por LPS, que tem participação notável da IL-1 . Tal fato sugere o envolvimento de outros mecanismos e mediadores, bem como a sinergia entre estes no processo. Sabe-se que existe um alto custo metabólico associado ao aumento da temperatura corpórea e sua manutenção (KLUGER, 1991; DANTZER, 2001), por isso acredita-se que a febre tenha um valor adaptativo e aventa-se que a elevação de temperatura verificada na PS não seja apenas um efeito do estresse, mas um

fenômeno determinado por outros fatores, ainda desconhecidos e que precisam ser melhor investigados.

7. CONCLUSÕES

1. A hipertermia induzida pela privação de sono pode ser observada logo na 2ª hora de PS e se mantém durante as 96 horas de privação;

2. O tratamento de 2 µg/Kg de anticorpo anti-IL-1 não teve a propriedade de suprimir ou reverter a hipertermia induzida pela privação de sono, indicando um papel não primordial da IL-1 nesse aumento de temperatura;

3. A mesma dose de anticorpo, no entanto, retardou o aumento de temperatura desencadeado pela administração de 100 µg/Kg LPS, mostrando participação notável da IL-1 na febre induzida por LPS;

4. O aumento significativo de temperatura gerado pela PS se dá mais rapidamente do que aquele induzido pelo LPS, o que pode sugerir a ativação de mecanismos distintos para o disparo de ambos. Além disso, a hipertermia desencadeada pela PS parece ter maior magnitude do que aquela induzida por 100 µg/Kg LPS.

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