Experimento realizado

2.2.5.1 Delineamento experimental e análises estatísticas

O delineamento experimental adotado foi o inteiramente aleatorizado com 19 tratamentos e 93 repetições, totalizando 1767 unidades experimentais. Cada unidade experimental foi composta por 1 frasco com 4 explantes, totalizando 7068 explantes.

O experimento foi conduzido em duas etapas em função da limitação de espaço na sala de crescimento das culturas e da operacionalização do ensaio. A 1a e a 2a etapa foram conduzidas com 10 tratamentos e 9 tratamentos, respectivamente. Houve um intervalo de 30 dias entre o início da elaboração das mesmas.

As análises estatísticas foram realizadas no sistema computacional estatístico SAS (SAS INSTITUTE, INC, 1997).

2.2.5.1.1 Definição dos tratamentos

O meio de cultura básico utilizado no estudo foi o meio JADS definido com base em informações sobre teores de nutrientes minerais obtidos em material jovem de Eucalyptus

grandis.

Os tratamentos constaram de variações nas concentrações dos macronutrientes indicadas na Tabela 5, sendo a concentração 2 correspondente às concentrações de macronutrientes do meio de cultura básico (JADS).

Tabela 5 - Concentrações, em mmol L-1_{, de macronutrientes definindo os tratamentos do experimento onde a} concentração 2 refere-se ao meio de cultura básico JADS

Meios de cultura (tratamentos)

1 2 (JADS) 3 4 Macronutrientes mmol L-1 Nitrogênio (N) 17,3 26,0 39,0 58,5 Fósforo (P) 2,0 3,0 4,5 6,75 Potássio (K) 7,3 11,0 16,5 24,75 Cálcio (Ca) 3,3 5,0 7,5 11,25 Magnésio (Mg) 2,0 3,0 4,5 6,75 Enxofre (S) 2,29 3,29 4,79 7,04

Meio de cultura JADS (CORREIA et al., 1995)

A composição, fonte de nutriente, respectivos balanços iônicos e relação NO3-:NH4+ dos

meios de cultura modificados em função das variações das concentrações dos macronutrientes encontram-se nos Anexos 1 a 6. Pode-se observar que as concentrações dos nutrientes no meio de cultura básico (2–JADS) foram mantidas constantes nos meios modificados para diferentes concentrações de macronutrientes, exceto para a concentração de SO42- na concentração 1 de

magnésio (Anexo 5) onde a mesma não foi balanceada. Desta forma, a concentração Mg1

apresenta 5,29 mmol L-1 de SO42- ao invés de 3,29 mmol L-1 SO42- existente no meio JADS.

Também, houve variação da concentração de Cl- em relação à existente no JADS em função do ajuste iônico nos tratamentos com nitrogênio (N1), potássio (K3 e K4) e cálcio (Ca3 e Ca4).

2.2.5.1.2 Análise estatística do crescimento de brotações em função de períodos de cultivo

O crescimento de brotações foi analisado durante 21 dias de cultivo (0; 7; 14 e 21). Em cada período, 12 unidades experimentais foram aleatoriamente escolhidas sendo utilizadas 48 unidades experimentais no total, por tratamento.

As variáveis massa fresca, massa seca, porcentagem de massa seca e taxa de crescimento relativo foram avaliadas. Efetuou-se a análise exploratória dos dados para averiguar as pressuposições de homogeneidade de variâncias, independência dos erros, distribuição normal dos erros, observações discrepantes, efeito de escala, tamanho da amostra para estimar o ruído ao nível nominal e observações influentes. Posteriormente, as análises estatísticas dos resultados experimentais foram realizadas pela análise de variância da regressão tendo como variáveis respostas massa fresca, massa seca, porcentagem de massa seca e taxa de crescimento relativo e, como variável independente, o período de cultivo.

A escolha do melhor modelo foi baseada nos coeficientes de determinação ajustados (R2) e na significância do teste de F do modelo, na significância dos coeficientes de regressão pelo teste ‘t’, de Student considerando um nível aceitável de significância de 1% (BANZATTO; KRONKA, 1995).

Em cada período desta etapa, como também aos 4 dias de cultivo foi verificado o pH dos meios de cultura. Para isto, foram utilizadas 5 unidades experimentais de cada tratamento escolhidas aleatoriamente na medição realizada no 4° dia, e 5 unidades experimentais entre as 12 unidades escolhidas para as avaliações de crescimento no 7°, 14° e 21° dia.

2.2.5.1.3 Análises estatísticas de crescimento, de teores de nutrientes minerais e de parâmetros bioquímicos em brotações aos 21 dias de cultivo in vitro

Foram utilizadas 30 unidades experimentais por tratamento, escolhidas aleatoriamente, para a análise do crescimento e de teores de nutrientes minerais em brotações, aos 21 dias de cultivo. Posteriormente, com a massa seca destas unidades experimentais foram estabelecidos 3 grupos constituídos por 10 unidades experimentais cada um, para análise química dos nutrientes minerais e determinando 3 repetições por nutriente analisado. Das 10 unidades experimentais

restantes, coletaram-se brotações aleatoriamente dos explantes para realizar as análises bioquímicas com 3 repetições por variável analisada.

A análise exploratória dos dados foi realizada para averiguar as pressuposições de homogeneidade de variâncias, independência dos erros, distribuição normal dos erros, observações discrepantes, efeito de escala e tamanho da amostra para estimar o ruído ao nível nominal. As transformações dos dados foram definidas de acordo com a potência ótima de Box- Cox. Os efeitos dos tratamentos nas variáveis estudadas foram avaliados mediante análise de variância e teste de Tukey (α = 0,05).

Aplicou-se uma análise de correlação (coeficiente de correlação de Pearson, p<0,05; Anexo 19) aos dados relacionados ao crescimento, teores de nutrientes minerais e bioquímicos com a finalidade de verificar a intensidade de associação entre estas variáveis. Todas as variáveis foram testadas, exceto a taxa de crescimento relativo por ter apresentado colinearidade com os dados de massa seca. A análise foi realizada com dados de três repetições por tratamento. Para isto, os dados das variáveis relacionadas ao crescimento contendo 30 repetições, foram reunidos em 3 grupos compostos por 10 unidades experimentais cada um. Desta forma, estabeleceram-se três repetições para esta análise.

Adicionalmente, com a verificação de elevado número de correlações significativas entre as variáveis indicadas na matriz de correlação de Pearson (Anexo 19), foi possível submeter os dados relacionados ao crescimento, teores nutricionais e bioquímicos a uma análise multivariada por componentes principais, permitindo desta forma, agrupar as variáveis significativas (coeficientes dos componentes a um valor maior a 0,65 nos auto-vetores) em poucos componentes, facilitando a interpretação das informações. Além disso, a visualização das relações entre variáveis, entre tratamentos e entre variáveis e tratamentos (Anexo 20) que mais influenciaram na multiplicação de brotações foi apresentada em um gráfico ‘biplot’ (GABRIEL, 1971). Esta análise estatística, representada graficamente, foi definida utilizando os valores médios de cada variável por tratamento.