Experimento em vasos com solo

Um experimento em vasos com solo não estéril foi montado no delineamento de blocos casualizados, no esquema fatorial 3x2x2+4, totalizando 16 tratamentos com quatro repetições cada. Os fatores foram a estirpe de bactéria (USDA 110, BR 29 e Sp 245), a dose aplicada (104 e 106 UFC mL-1) e a fonte de N (R. tropici CIAT 899 e N mineral). Além disso, foram incluídos 4 tratamentos adicionais, a saber: testemunha absoluta, testemunha nitrogenada, testemunha inoculada com R. tropici e testemunha de co-inoculação de R. tropici com o produto comercial AZOTOTAL®.

O experimento foi conduzido em casa de vegetação na Embrapa Agrobiologia, no período compreendido entre os meses de julho a agosto de 2014, em conformidade às

exigências do Protocolo Oficial para Avaliação da Viabilidade e Eficiência Agronômica de Cepas, Inoculantes e Tecnologias Relacionados ao Processo de Fixação Biológica do Nitrogênio em Leguminosas (BRASIL, 2011).

O ensaio foi conduzido em vasos com solo, o substrato proveio do horizonte A de um Argissolo Vermelho Amarelo oriundo da área experimental da Embrapa Agrobiologia, peneirado em malha de 4 mm. A análise química de fertilidade do solo foi realizada segundo a metodologia descrita pela Embrapa (1997) no Laboratório de Química Agrícola da Embrapa Agrobiologia, obtendo-se os seguintes resultados: pH de 5,6; P (Mehlich-1) de 1,92 mg L-1; Al3+ de 0,08 cmolc dm-3; Ca2+ de 1,98 cmolc dm-3; Mg2+ de 0,87 cmolc dm-3 e K de 26,00 mg L-1.

Em cada vaso de 4 kg foi realizada a calagem com a aplicação e posterior homogeneização de 7 g de CaCO3 para a neutralização do Al3+ tóxico e fornecimento de Ca2+. Quinze dias após a calagem, os vasos foram adubados com soluções de nutrientes, nas seguintes doses: 10 mg kg-1 de Mg, como MgSO4.7H2O; 2 mg kg-1 de Cu, como CuSO4.5H2O; 1 mg kg-1 de Zn, como ZnSO4.7H2O; 0,1 mg kg-1 de B, como H2BO3; 0,2 mg kg-1 de Mo, como Na2MoO4.2H2O, 1 mg kg-1 de Fe, como Fe-EDTA e 80 mg kg-1 de P, na forma de KH2PO4. Por sua vez, os vasos sob adubação nitrogenada receberam 60 mg kg-1 de N, como (NH4)2SO4. Posteriormente, o solo de cada vaso foi homogeneizado. Os tratamentos co-inoculados não foram submetidos à adubação nitrogenada mineral.

O plantio foi realizado em julho de 2014; a cultivar utilizada foi a Pérola, sendo semeadas quatro sementes por vaso com posterior desbaste para duas plantas aos 7 dias após a emergência das plântulas.

Como estirpe de rizóbio, foi utilizada a CIAT 899 de Rhizobium tropici, registrada e recomendada pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) para a produção de inoculantes de feijoeiro comum. As estirpes de promotores de crescimento testadas foram a SEMIA 5019 (BR 29) de Bradyrhizobium elkanii, SEMIA 5080 (BR 116) de

Bradyrhizobium diazoefficiens e Sp 245 de Azospirillum brasilense. O preparo do inóculo foi

o mesmo utilizado para o experimento em vasos de Leonard.

As sementes foram desinfestadas por imersão durante 30 segundos em álcool 96º GL e dois minutos em peróxido de hidrogênio P.A., sendo posteriormente lavadas por dez vezes em água destilada esterilizada. Foram semeadas quatro sementes desinfestadas por vaso com posterior desbaste para duas plantas aos 7 dias após a emergência das plântulas. A semeadura foi realizada em julho de 2014.

No momento do plantio, cada semente foi inoculada com 1 mL do inoculante de R.

tropici e 1 mL da bactéria promotora de crescimento de planta nas concentrações

correspondentes. Os tratamentos que receberam adubação nitrogenada não foram inoculados com rizóbio e receberam a aplicação de 1 mL dos inoculantes com bactérias promotoras de crescimento. Todas as sementes foram posteriormente cobertas com uma camada de aproximadamente 1 cm de terra.

As avaliações foram realizadas em plantas coletadas aos 45 dias após o plantio (florescimento pleno). A parte aérea e as raízes foram acondicionadas separadamente em sacos de papel, postas a secar em estufa de circulação forçada a 65 °C até atingirem massa constante e pesadas para determinação do peso de matéria seca. As amostras da parte aérea foram posteriormente moídas e submetidas à digestão sulfúrica para a determinação dos teores de N pelo método semimicro Kjeldahl, segundo Malavolta et al. (1997); o conteúdo de N foi obtido pelo produto entre a biomassa e o teor de N. Os nódulos foram secos em estufa de circulação forçada a 65 °C até atingirem peso constante para a determinação da massa seca.

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Figura 2. Visão geral do experimento em vasos com solo. Fonte: Rennan Bastos (2014).

O sistema radicular foi lavado e recuperado juntamente aos nódulos desprendidos com auxílio de peneira de malha de 2 mm. Foi determinada a atividade da enzima nitrogenase através da técnica de redução de acetileno. Raízes e nódulos foram colocados em frascos de vidro de 250 mL hermeticamente fechados; inicialmente foram retirados 30 mL de ar com auxílio de seringa sendo, posteriormente, aplicados 30 mL de acetileno através de uma seringa de injeção. Após um período de incubação de 30 min, coletou-se uma amostra de 1 mL, sendo injetado 0,5 mL para leitura da concentração de etileno em cromatografia gasosa. Foi utilizado o cromatógrafo a gás do modelo Perkin-Elmer L Auto System e Integrador PE Nelson Modelo 1022 com Detector de Ionização de Chama (FID – Flame Ionization Detector) e coluna cromatográfica Poropak N. O padrão de etileno foi determinado, injetando-se no cromatógrafo 1,0 mL de etileno puro. Os valores de etileno produzido foram convertidos para µmol C2H4 h-1 planta-1, considerados como atividade da nitrogenase. A atividade específica da nitrogenase foi calculada através da razão entre a atividade da nitrogenase e a massa seca de nódulos de cada vaso.

As raízes e nódulos foram acondicionados em frascos de vidro hermeticamente fechados e reservados em geladeira para que se procedesse a contagem do número de nódulos. Os nódulos foram destacados e contados e secos em estufa de circulação forçada a 65 °C até o peso constante e pesados.