5. MATERIAIS E MÉTODOS
5.8. EXPERIMENTOS COM MACRÓFAGOS PERITONEAIS DE
5.8.1. Efeito in vitro de ARAGAL na viabilidade celular
Células do exudato peritoneal foram obtidas como já descrito no item 5.5.1. Em placas de 96 poços, macrófagos aderentes foram cultivados na presença de
diferentes concentrações de ARAGAL (10 – 300 µg.mL-1), no grupo controle os macrófagos foram cultivados na ausência do polissacarídeo. Após 1, 2, 3, 4, ou 5 horas, o meio foi retirado e a viabilidade da monocamada de macrófagos foi avaliada segundo o método do MTT conforme descrito anteriormente (item 5.6.2).
5.8.2. Efeito de ARAGAL na atividade elicitora de células
Para a determinação da atividade elicitora de ARAGAL, foram utilizados grupos de 4 camundongos albinos Swiss. Os animais do grupo controle receberam intraperitonealmente (i.p.) PBS estéril enquanto que os animais do grupo tratado receberam 50, 100 ou 200 mg.kg-1 de ARAGAL. Após 24 h, os animais foram sacrificados por asfixia com éter etílico e as células do exudato peritoneal foram obtidas como descrito no item 5.5.1. O número de macrófagos no fluido peritoneal de cada um dos animais de ambos os grupos foi contado em câmara de Neubauer em microscópio invertido (Olympus, mod. KW1).
5.8.3. Efeito de ARAGAL na ativação: ensaios in vitro e in vivo 5.8.3.1. Ensaio in vitro
Células do exudato peritoneal, obtidas como descrito no item 5.5.1, foram plaqueadas na densidade de 5 x 105 células por poço em placas de cultura de 24 poços contendo lamínulas de vidro estéreis. Os macrófagos do grupo tratado com ARAGAL foram cultivados em MC acrescido de diferentes concentrações do
polissacarídeo: 10, 25, 50, 100, 200 e 300 µg.mL-1, enquanto que os macrófagos do grupo controle foram cultivados apenas em MC. Após 24 ou 48 h em estufa a 37oC e atmosfera de 5% CO2, o sobrenadante foi descartado, as lamínulas contendo as monocamadas de macrófagos foram lavadas duas vezes em PBS e processadas para microscopia de luz como descrito no item 5.7.
5.8.3.2. Ensaio in vivo
Nos experimentos visando avaliar a ativação de macrófagos in vivo, foram utilizados grupos de 10 camundongos. Os animais do grupo controle foram inoculados com PBS estéril (i.p.), enquanto que os animais do grupo tratado foram inoculados (i.p.) com 100, 250 ou 500 mg.kg-1 de ARAGAL. Sete dias após a inoculação, os animais de ambos os grupos foram sacrificados e as células do exudato peritoneal foram obtidas como descrito no item 5.5.1 e plaqueadas na densidade de 5 x 105 células por poço em placas de cultura de 24 poços contendo lamínulas de vidro estéreis. Os macrófagos de ambos os grupos foram cultivados durante 24 h em MC à 37oC, em atmosfera de 5 % CO
2, em seguida o sobrenadante foi descartado, as lamínulas contendo as monocamadas de macrófagos foram
lavadas 2 X em PBS e processadas para microscopia de luz como descrito no item 5.7.
5.8.4. Efeito de ARAGAL na capacidade fagocítica
A capacidade fagocítica foi avaliada de acordo com a metodologia descrita por RAMESH et al. (2002) e BUCHI et al. (1993), utilizando leveduras como partículas fagocíticas. As leveduras, obtidas a partir de fermento biológico, foram preparadas por 3 lavagens consecutivas em PBS estéril, pH 7,4 e mantidas a 4 oC até utilização. Para o ensaio de fagocitose, as células do exudato peritoneal foram obtidas como já descrito (item 5.5.1) e plaqueadas na densidade de 5 x 105 células por poço em placas de cultura de 24 poços contendo lamínulas de vidro estéreis. Os macrófagos do grupo tratado com ARAGAL foram cultivadas em MC acrescido de
diferentes concentrações do polissacarídeo: 25, 50 e 100 µg.mL-1, enquanto que os macrófagos do grupo controle foram cultivados em MC na ausência do polissacarídeo. Após 24 h, o sobrenadante foi descartado e as lamínulas contendo as monocamadas de macrófagos foram lavadas duas vezes em meio MEM com antibióticos e sem SFB. Em seguida, as lamínulas foram incubadas com leveduras na proporção de 10 leveduras para cada macrófago. Após 15, 30, 45, 60, 90 e 120 minutos as lamínulas foram lavadas três vezes com PBS, para retirada das leveduras que não foram fagocitadas, e processadas para microscopia de luz conforme descrito no item 5.7.1. Utilizando objetiva de 1000 vezes de aumento, foram contados o número total de macrófagos, o número de macrófagos que fagocitaram leveduras e o número de leveduras fagocitadas. Os resultados foram
expressos como índice endocítico (IE) que foi determinado de acordo com BUCHI et al. (1993) e RAMESH et al. (2002) com a seguinte fórmula:
Onde: IE = índice endocítico, Lf = número de leveduras fagocitadas, M∅Sf = número de macrófagos que fagocitaram, M∅ST = número de macrófagos totais.
5.8.5. Produção de ânion superóxido por macrófagos peritoneais de camundongos tratados com ARAGAL
Foram utilizados grupos de 10 camundongos albinos Swiss. Os animais do grupo controle foram inoculados com PBS estéril (i.p.), enquanto que os animais do grupo tratado foram inoculados (i.p.) com 100 ou 200 mg.kg-1 de ARAGAL. Sete dias após a inoculação, os animais de ambos os grupos foram sacrificados e as células do exudato peritoneal foram obtidas como já descrito e plaqueadas na densidade de 5 x 105 células por poço em placas de cultura de 96 poços. Após o período de 30 minutos, necessário para aderência dos macrófagos, as monocamadas dos grupos tratados com ARAGAL e do grupo controle foram incubadas com o meio de reação
constituído de HBSS e ferricitocromo c (80 µmol.L-1) (SASADA et al., 1983). Em cada um dos grupos, a metade dos poços contendo macrófagos foram incubados na
presença 1 µg.mL-1 de PMA no meio de reação, a outra metade na ausência de PMA. Após a incubação por 15, 30, 45 ou 60 minutos, 150 µL do meio de reação dos diferentes grupos foi transferido para outra placa e a absorbância em 550 nm foi medida em leitor de microplacas Bio-RAD modelo Benchmark. A concentração de
IE = Lf M∅Sf . M∅Sf
citrocomo c reduzido, que corresponde a concentração de ânion superóxido produzido pelos macrófagos, foi determinada utilizando o Coeficiente de Extinção
Molar para a mistura citocromo Coxid.red.∆ε = 2,1 x 104 M-1 cm-1 (JOHNSTON et al., 1978).
5.8.6. Produção de óxido nítrico por macrófagos peritoneais de camundongos tratados com ARAGAL
Para avaliação da produção de NO por macrófagos de animais tratados com ARAGAL, foram utilizados grupos de 10 camundongos albinos Swiss. Os animais do grupo controle foram inoculados com PBS estéril (i.p.), enquanto que os animais do grupo tratado foram inoculados (i.p.) com 200 mg.kg-1 de ARAGAL. Sete dias após o tratamento, os animais de ambos os grupos foram sacrificados e as células do exudato peritoneal, obtidas como descrito no item 5.5.1, foram plaqueadas na densidade de 5 x 105 células por poço em placas de cultura de 96 poços. Após o período de 30 minutos, as monocamadas do grupo tratado com ARAGAL e do grupo controle foram incubadas em MC na presença ou ausência de 50 ng.mL-1 de LPS +
26 U.mL-1 de IFN-γ. Após 24 horas em estufa a 37oC e atmosfera de 5 % CO
2, 100
µL do sobrenadante foi transferido para outra placa, procedendo-se a dosagem de NO com uso do reagente de Griess (GREEN et al., 1982). Este é constituído pela mistura de duas soluções A e B na proporção 1:1, imediatamente antes do uso. A solução A é constituída por: naftiletilenodiamino 0,1% (p/v) em ácido orto-fosfórico 5% (v/v), e a solução B por sulfonamina p-aminobenzeno 1% (p/v) em ácido fosfórico 5% (v/v).
Aos 100 µL do sobrenadante adicionou-se 100 µL do regente de Griess seguindo-se incubação por 10 minutos. A absorbância em 550 nm foi medida em leitor de microplacas Bio-RAD modelo Benchmark. A concentração de nitrito foi determinada utilizando uma curva padrão de NaNO2. Alternativamente, ARAGAL foi
previamente tratada com polimixina B (50 µg.mL-1) por 40 minutos antes do uso.
5.8.7. Produção de TNF-α por macrófagos peritoneais de camundongos tratados com ARAGAL
Na avaliação da produção de TNF-α por macrófagos peritoneais de camundongos, foram utilizados grupos de 10 camundongos (Swiss). Os animais do grupo controle foram inoculados com PBS estéril (i.p.), enquanto que os animais do grupo tratado foram inoculados (i.p.) com 100 mg.kg-1 de ARAGAL. Um terceiro
grupo de animais foi inoculado com 50 µg.kg-1 de LPS, servindo como controle positivo. Uma ou 24 h após a inoculação, os animais foram sacrificados por asfixia com éter etílico e o fluido peritoneal foi coletado com 2 mL de PBS estéril e mantido a 4oC. Em seguida o fluido peritoneal foi centrifugado a 1080 g por 6 minutos, o “pellet” de células foi descartado e o sobrenadante foi congelado à –70 oC até o uso.
Os níveis de TNF-α no fluido peritoneal foram medidos por “enzyme-linked immunosorbent assay” (ELISA) (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA), segundo as especificações dos fabricantes. Nestas determinações, placas de 96 poços foram
cobertas com 100 µL de anticorpo anti-TNF-α de camundongo (1 µg.mL-1) e incubadas 12 h a 25 oC. Após esse tempo, TNF-α recombinante murino (31,2 – 2000 pg.mL-1) e as amostras coletadas dos animais (diluídas 1:2) foram adicionadas aos poços e as placas foram novamente incubadas por mais 12 h a 25 oC. Após, a
solução de PBS contendo 1% de soro albumina bovina (p/v) (BSA), 5% (p/v) sacarose and 0.05% (p/v) NaN3 foi adicionada a cada um dos poços e incubada por 1 h. Após 3 lavagens com o tampão de lavagem, composto por PBS e Tween 20 a
0,05% (v/v), 100 µL de anticorpo anti-TNF-α de camundongo biotinilado (50 ng.mL-1) foi adicionado em cada poço da placa. A placa foi então incubada por 2 h à temperatura ambiente. Após a remoção do anticorpo biotililado em excesso e 3
lavagens em tampão de lavagem, 100 µL de solução de estreptoavidina HRP foi adicionado em cada poço e a placa foi levada à 25oC por 20 minutos. Em seguida
100 µL de solução de substrato contendo peróxido de hidrogênio e tetrametilbenzidina foi adicionado aos poços e incubado por 25 minutos para o
desenvolvimento da reação de cor, em seguida foi adicionado 50 µL de solução de ácido sulfúrico 1mol.L-1. A densidade óptica foi determinada em 450 nm usando um leitor de microplacas (Sunrise Touchscreen, TECAN, Crailsheim, Germany).