1. Animais
Para os experimentos foram utilizados camundongos machos selvagens da linhagem C57BL/6J com 8 semanas de idade adquiridos do CEMIB/Unicamp, pesando aproximadamente 25±2 gramas. Os experimentos foram aprovados pelo comitê de ética em experimentação Animal/Unicamp (CEUA), sob o número de protocolo 4027-1. Os camundongos foram mantidos no biotério do Departamento de Biologia Celular e Estrutural, sob responsabilidade da Profª Dra Cristina Pontes Vicente, em gaiolas micro- isoladoras, receberam água e ração (NUVILAB) ad libitum, e foram colocados em ciclo claro e escuro de 12 horas. Os animais foram utilizados para isolar as células de músculo liso e divididos em grupos com lesão arterial.
2. Isolamento e cultivo das células de músculo liso
As células de músculo liso foram isoladas da artéria aorta de camundongos C57BL/6J, para isto adaptou-se o protocolo de Ray, J. at. al [171]. Resumidamente, os camundongos foram eutanasiados com aprofundamento de anestesia (quetamina, 500mg/kg). Após fez-se uma incisão na região torácica para dissecar a artéria aorta, em seguida removeu-se a camada adventícia com o auxílio de pinças, e fez-se um corte longitudinal e uma raspagem com auxílio de bisturi na região interna da aorta afim de evitar a contaminação por outros tipos celulares.
Em seguida lavou-se a aorta em PBS acrescido de 1% de penicilina, após o tecido foi colocada em placas petri contendo colagenase II 1mg/mL (Sigma) e tripsina (Nutricell) 1:5 em meio DMEM (Nutricell) onde as artérias foram cortadas em pedaços
de 1- 2mm com bisturi, após este procedimento o material foi passado para tubos falcon de 15ml, colocados em estufa de CO2 a 37ºC por 50 min para digestão do tecido, os tubos eram homogeneizados a 10min. Após este período o material foi centrifugado á 1500rpm por 10min, o precipitado foi homogeneizado com DMEM suplementado de 15% de soro fetal bovino (SFB) (Nutricell), 1% de penicilina e plaqueados em placas de 6well, mantidos em estufa úmida de CO2 a 37ºC. Após 72h foi acrescido 500ul de DMEM 15% SFB. A troca de meio foi feita a cada 48h até as células atingirem a confluência. Quando confluentes, as culturas foram passadas por tripsinização e utilizadas para os experimentos entre a 6º e 8º passagem.
3. Caracterização das células de músculo liso
Para a caracterização das células musculares e confirmação do seu fenótipo foi feito uma imunofluorescência, do modo descrito a seguir. As células foram cultivadas em placa de 24 poços com lamínulas. Após a confluência, as células foram fixadas, com paraformaldeído (4%) e Triton X-100 (0,6%) por 20 minutos a 4ºC, em seguida permeabilizadas com Tween 20 (0,1%) em PBS por 5 min, bloqueou-se com PBS/BSA (soro albumina bovina) (2%) acrescido de Triton X-100 (0,8%) por 1h. O anticorpo primário alfa-actina (Invitrogen), para células de músculo liso, foi diluído (1:100) e incubado overnight a 4ºC. Após a incubação, as células foram lavadas 3x de 5min com PBS para retirar o excesso de anticorpo primário, incubou-se com o anticorpo secundário, anti-rabbit Alexa Fluor 594 (Invitrogen), diluído 1:250 por 1h a temperatura ambiente. Lavou-se 3x com PBS e para a marcação dos núcleos foi utilizado com DAPI (0,5 μg/mL em metanol), incubados por 10 minutos a 37ºC, lavou-se 3x em PBS. As lâminas foram montadas, em meio para fluorescência, observadas em Microscópio de Fluorescência (Olympus BX60, câmera QColor 3) e capturadas pelo programa QCapture 4.0.
4.Ensaio de proliferação com sulforodamina B
Para o ensaio de proliferação, 1x103 células de músculo liso/poço, foram plaqueadas em placas de 96 poços, com 150µL de DMEM suplementado com 15% SFB, após 24h de cultivo, fez-se a troca do meio e foram adicionados os tratamentos. No grupo controle as células foram mantidas em DMEM com 15% de SFB, para os tratamentos adicionou-se; Heparina (50 e 25µg/mL), HBPM (50 e 25 µg/mL) e DS (50 e 25µg/mL), após 24h ou 48h fez-se o ensaio de sulforrodamina B.
Este ensaio mede a densidade celular baseado no teor de proteína celular [172]. O corante sulforodamina B é um corante rosa brilhante com dois grupos sulfônicos que têm a capacidade de se ligar elestrostaticamente aos resíduos básicos dos aminoácidos, permitindo então uma dosagem de proteínas totais na cultura celular [173].
Para este ensaio, as células foram fixadas em ácido tricloroacético 50% (TCA), por 1h à 4ºC, em seguida adicionou-se o corante sulforrodamina B (0,4%), por 30min a 4ºC, lavou-se as células 4x com ácido acético glacial, para remover o excesso do corante e o mesmo foi solubilizado com 150µl de trizma base 10uM, a leitura espectrofotométrica da absorbância foi realizada em 940 nm em um leitor de microplacas (Biotek® - Synergy/USA). A partir deste ensaio escolheu-se o tempo e a concentração dos tratamentos.
5. Ensaio de proliferação com MTT
Realizamos o ensaio de MTT (brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2yl) -2,5-difenil tetrazolium), este também é um ensaio muito utilizado para medir a proliferação celular. Para a realização do MTT as células foram plaqueadas, cultivadas e tratadas da mesma forma que no ensaio anterior. Porém para este o ensaio foi realizado apenas na concentração de 25µg/mL durante 24 horas.
No ensaio de MTT o substrato foi acrescido nas células numa concentração de 5mg/mL e incubado no escuro por 3 horas a 37ºC, em seguida removeu-se o meio de cultura e adicionado 100ul de solvente DMSO, agitou-se por 15min fez-se a leitura da placa em leitor de ELISA a um comprimento de onda de 595nm.
6. Ensaio de cicatrização
O ensaio de cicatrização foi realizado da seguinte maneira: as células de músculo liso foram semeadas em placas de 24 poços, em um n=3/grupo, numa densidade de 5x104 células/poço, estas cresceram em meio DMEM com 15% de SFB,
até atingirem confluência. Em seguida, simulou-se uma lesão em linha paralela ao longo do diâmetro da placa, com o auxílio de uma ponteira de 200µl estéril, trocou-se o meio, adicionando-se os tratamentos com os GAGs, o grupo controle foi adicionado apenas DMEM suplementado com SFB.
Foram realizados, três tratamentos diferentes, Heparina (25µg/mL), HBPM (25 µg/mL) e DS (25µg/mL), as drogas foram adicionadas ao meio DMEM com 1% de SFB, para o controle foi adicionado apenas DMEM com 1% de SFB. Após a lesão, as placas foram fotografadas em microscopia utilizando time lapse (a cada 30 minutos por 24 horas) no microscópio Zeiss Observer Z.1 (Zeiss, Alemanha), através do software Zeiss Zen, em aumento de 200x. A análise da cicatrização foi feita pelo software Fiji Image J nos tempos 0, 6, 12, 18 e 24h.
7. Zimografia para gelatinases em células de músculo liso
Para a extração de proteínas das células de músculo liso trabalhamos com placas de 10cm² confluentes para cada tratamento e o controle. Os tratamentos foram feitos numa concentração de 25µg/mL durante 24h, após este período, as células foram tripsinizadas e a extração proteica realizada com tampão de extração (Tris 50nM, NaCl 0,2M, Triton X-100, CaCl2, pH 7,4 com coquetel anti-protease), para cada placa
utilizou-se 100ul. As células foram homogeneizadas com auxílio de sonicador, e as amostras foram colocadas em gelo por 2h para extração das proteínas. As amostras foram centrifugadas a 4ºC, numa velocidade de 8000rpm por 20 min, o sobrenadante foi coletado e quantificado por Bradford. Utilizou-se 20ug de proteína em cada poço para cada tratamento analisado.
O gel de poliacrilamida de 10% contendo 1% de gelatina foi desenvolvido a 4ºC após o final da eletroforese foi lavado por 2x de 30min sob agitação, numa solução de 2,5% de Triton X-100 e incubado a 37ºC por 24h sob agitação em uma solução de Tris
HCL50mM, NaCl 0,1M, CaCl2, ácida sódica 0,02%, pH7,4. O gel foi corado com
Coomassie brilhant blue R-250 (Sigma) por 30min. Depois disso os géis foram lavados com uma solução contendo etanol 30% e ácido acético 10% para observação das bandas com atividade das enzimas. As bandas em imagem negativa foram quantificadas usando o software ImageJ.