Explorando regiões atípicas dos genomas bacterianos

Streptococcus mutansassociada com a resistência de antibióticos [Nan et al., 2009]. Também temos

estudos com PHs de Mycobacterium tuberculosis, no qual Doerks et al. [2012] adicionaram informa- ções a mais da metade das PHs presentes nesse genoma e Mazandu & Mulder [2012] realizaram uma predição funcional das PHs e concluíram que muitas dessas proteínas estão associadas à habilidade de invadir e de adaptação no hospedeiro. Shahbaaz et al. [2013] exploraram as PHs de Haemophi-

lus influenzaeRd KW20, apontando ao final da análise potenciais alvos terapêuticos. Nesse mesmo

sentido, Candida dubliniensis teve várias de suas PHs anotadas funcionalmente, na qual Kumar et al. [2014] identificaram proteínas relacionadas com a patogenicidade do microrganismo.

Sabendo da importância que a caracterização de PHs possui, muitos métodos e ferramentas de bioinformática têm sido empregados na tentativa de identificá-las [Lubec et al., 2005]. Sendo que, o método mais comumente usado para inferir função é por homologia de sequência através de alinha- mentos, onde o programa mais utilizado é o BLAST (Basic Local Alignment Search Tool - Altschul

et al.[1990, 1997]).

Além disso, a análise de motivos (conjunto de aminoácidos conservados importantes para a fun- ção) e domínios proteicos (unidade tridimensional independente e compacta que compõe proteínas) é uma etapa obrigatória na caracterização de PHs, e para isso contamos com bancos de dados e fer- ramentas para essa classificação, como o CATH [Sillitoe et al., 2013], Interpro [Hunter et al., 2009], Pfam [Finn et al., 2010], ProDom [Bru et al., 2005], PROSITE [Sigrist et al., 2012], entre outros.

Nesse tipo de análise é importante priorizar alvos de estudo, para que possam ser apontados para uma validação experimental [Galperin & Koonin, 2004]. Nosso interesse em explorar as PHs das estirpes CPAC 7 e CPAC 15 é aumentar o conhecimento sobre o aparato proteico de cada bactéria, identificar proteínas que possam estar associadas com a capacidade simbiótica e ainda apontar alvos para estudos experimentais posteriores.

2.5 Explorando regiões atípicas dos genomas bacterianos

Genomas bacterianos apresentam uma estrutura simples, são compactos, sendo que cerca de 90% de seu conteúdo é informativo, o restante corresponde a regiões não codificantes de proteínas, em

2.5. EXPLORANDO REGIÕES ATÍPICAS DOS GENOMAS BACTERIANOS 15

geral constituem regiões regulatórias [Casjens, 1998; Rocha, 2008].

Os genes procarióticos são compostos, basicamente, pela região codificadora flanqueada por re- giões regulatórias, à montante e à jusante [Casjens, 1998]. Diferente de organismos eucariotos, a presença de íntrons é extremamente rara [Casjens, 1998; Rocha, 2008]. Muitos desses genes podem ainda estar organizados em operons, que são unidades funcionais, na qual duas ou mais regiões codifi- cadoras ocupam posições adjacentes, com a mesma orientação e têm sua transcrição controlada pelas mesmas sequências regulatórias [Rocha, 2008].

Algumas bactérias podem contar com a presença de plasmídeos, que são elementos genéticos móveis extracromossomais, cuja replicação é independente do DNA cromossomal, e são constituí- dos, entre outros, de genes que podem conferir características especiais às bactérias, como genes de resistência à antibióticos [Casjens, 1998; Rocha, 2008].

São nos cromossomos que as bactérias carregam os genes essenciais à manutenção celular, ou seja, o genoma central [Casjens, 1998; Bentley & Parkhill, 2004; Rocha, 2008]. Além das sequências de DNA dos genes essenciais, alguns cromossomos podem carregar outros DNAs integrados, como DNAs de bacteriófagos, ilhas genômicas (simbióticas ou patogênicas), elementos transponíveis, entre outros [Koonin et al., 2001; Lawrence & Hendrickson, 2005]. Tais elementos acessórios dos genomas contribuem para a variabilidade na estrutura genômica das bactérias, o que faz com que o genoma seja dinâmico, sujeito à inúmeras alterações como reorganização de sequências, fusão de replicons, transferência gênica horizontal, entre outros, mesmo entre linhagens de uma mesma espécie [Casjens, 1998; Koonin et al., 2001; Darmon & Leach, 2014].

Uma característica importante dos cromossomos bacterianos é que a distribuição de oligonucleo- tídeos é relativamente estável ao longo de todo DNA, sendo essa distribuição particular de cada orga- nismo [Karlin & Burge, 1995; Bohlin & Skjerve, 2009]. Regiões que possuem desvios nessa distribui- ção podem ser consideradas regiões atípicas ou anômalas, e frequentemente correspondem a regiões de DNA integrados no genoma [Bentley & Parkhill, 2004; Rocha, 2004; Darmon & Leach, 2014].

Portanto, sabendo das características desses genomas e de sua plasticidade, consideramos que as regiões atípicas dos genomas que passaram por modificações durante os processos evolutivos, pos- sam nos fornecer conhecimentos interessantes [Dufraigne et al., 2005]. Dessa forma, essa é mais

2.5. EXPLORANDO REGIÕES ATÍPICAS DOS GENOMAS BACTERIANOS 16

uma abordagem utilizada neste trabalho para identificar características distintas das estirpes CPAC 7 e CPAC 15. Na análise comparativa tradicional, foram identificadas várias ilhas genômicas nos cromossomos [Siqueira et al., 2014], entretanto nenhuma análise aprofundada foi realizada.

Além disso, acreditamos que essa abordagem deva ser mais empregada no direcionamento das análises de genomas procariotos. Assim, esse trabalho também propõe uma nova metodologia para discriminar regiões atípicas dos genomas bacterianos, no intuito de utilizar essa característica para guiar o pesquisador, de forma rápida, direto para regiões onde possa ter maior chance de identificar características exclusivas do genoma de interesse.

Há muito tempo os pesquisadores sabem da importância que essas regiões atípicas possuem para o microrganismo, por isso várias formas diferentes vêm sendo empregadas na tentativa de identificá-las [Karlin & Burge, 1995; Dufraigne et al., 2005]. Por exemplo, Garcia-Vallve et al. [2003] desenvol- veram o banco de dados HGT-DB, que possui genes possivelmente transferidos horizontalmente, em genomas bacterianos, com base no uso de códons e no conteúdo GC do genoma. Uma outra aborda- gem disponível é o IslandPath, uma ferramenta-web utilizada para identificar ilhas genômicas baseada na porcentagem GC e no viés de dinucleotídeos [Hsiao et al., 2003]. Um ano depois, mais um banco de dados com ilhas integrativas também foi disponibilizado (Islander), mas nesse caso, a identificação é baseada nos genes de tRNA [Mantri & Williams, 2004]. Posteriormente, Waack et al. [2006] desen- volveram a ferramenta SIGI-HMM para predizer ilhas genômicas usando modelo ocultos de Markov. E finalmente, Vernikos & Parkhill [2006] introduziram o método IVOMs (Interpolated Variable Order Motifs), conhecido também como Alien Hunter, com o mesmo objetivo.

Apesar de todos esses métodos disponíveis, o desafio é melhorar a performance, reduzir o tempo de execução computacional e os requisitos necessários para a análise (tipos de arquivos de entrada). Pois alguns deles precisam do arquivo de anotação para realizar as análises, ou no caso dos bancos de dados, onde só é possível analisar os genomas disponíveis nos mesmos. Sendo que seria interessante executar tal análise, também em genomas recém-sequenciados.

Por isso, esse estudo também propõe uma estratégia alternativa, simples e rápida computacional- mente para discriminar regiões nos genomas que devem ser priorizadas durante as análises.

2.5. EXPLORANDO REGIÕES ATÍPICAS DOS GENOMAS BACTERIANOS 17

por Shannon [1948], que aponta a distribuição de probabilidade que mede a informação de uma fonte [Shannon, 1948].

A ME foi proposta originalmente por Jaynes [1957a,b], onde basicamente determina a distribuição que representa o máximo de incerteza [Guiasu & Shenitzer, 1985]. E neste trabalho, utilizamos a ME com base no conhecimento prévio da frequência de oligonucleotídeos, para discriminar as regiões atípicas dos genomas, ou seja, as regiões que podem conter novas informações.

Portanto, primeiramente desenvolvemos uma nova metodologia, que pode ser aplicada na análise

de outros genomas. E em seguida, a utilizamos para discriminar regiões dos genomas de B. diazoeffi-

3

Objetivos

3.1 Objetivo Geral

E

que possam contribuir para a compreensão de suas diferenças simbióticas.