Para expressão heteróloga foi escolhida a porção N-terminal da sequência deduzida de aminoácidos. A escolha desta região levou em consideração os seguintes aspectos: os altos índices de antigenicidade da molécula, os putativos epítopos para células T, os peptídeos identificados no microssequenciamento da gp70 nativa e prováveis sítios de N-glicosilação, como mostrado na Figura 6 (região assinala pelo retângulo vermelho).
Um fragmento de DNA genômico com 946 pb em fase de leitura aberta, foi subclonado nos sítios EcoRI e SpeI do vetor pHIS3 (Figura 9A). O fragmento clonado corresponde aos aminoácidos 1 ao 315 de proteína Pbgp70 deduzida. Para verificar a presença do inserto no vetor de expressão (pHIS3), alguns clones recombinantes foram digeridos com as mesmas enzimas utilizadas para a construção do plasmídeo pHIS3Pbgp70 (Figura 9B). O inserto de clones positivos foi sequenciado e verificou-se que a fase aberta de leitura estava correta.
Os mesmos plasmídeos foram introduzidos em bactérias E. coli
BL21pLysS, apropriadas para expressão heteróloga de proteínas recombinantes. A indução da expressão foi feita após a adição de 0,5 mM de IPTG e foi monitorada ao longo do tempo de incubação a 37ºC. Nestas condições, observou-se o aparecimento de uma banda de aproximadamente 35 kDa após 4 e 6h de indução, a qual não foi observada no extrato total das bactéria não induzidas (0 h) ou contendo o vetor sem inserto (Figura 9C).
Foi realizada em seguida a análise da solubilidade da proteína recombinante por SDS-PAGE 12%. Para tal, as bactérias foram induzidas à expressão com IPTG por 4 horas e em seguida, foram lisadas. As porções solúvel e insolúvel foram analisadas separadamente e, como observado na Figura 10, a maior parte da proteína foi expressa na forma de corpos de inclusão insolúveis. Diante desses resultados, a purificação da proteína recombinante (Pbgp70r) em coluna de afinidade foi feita após solubilização com agente desnaturante (uréia).
Para a purificação de Pbgp70r, as bactérias foram induzidas em larga escala e processadas como descrito em Materiais e Métodos para a obtenção do extrato total bacteriano. O precipitado insolúvel foi ressuspendido em tampão contendo 8 M de uréia e o sobrenadante foi analisado em SDS-PAGE (Figura 11).
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O material foi aplicado em coluna de Ni-NTA e eluído em tampão 8 M de uréia em pH ácido e os eluatos foram analisados em SDS-PAGE 12%. Na Figura 11, é possível observar que a proteína recombinante foi melhor eluída nas frações de pH 4,5.
Após purificação em coluna de níquel, a proteína recombinante resultante foi utilizada na produção de anticorpos policlonais anti-Pbgp70r de coelhos. Aproximadamente 300 µg da proteína foram aplicados em gel de SDS-PAGE 12% para separar a proteína recombinante da uréia e de traços de outras proteínas bacterianas ligantes de níquel. O gel foi corado por Comassie blue e a banda correspondente à proteína recombinante foi excisada do gel, descorada, ressuspendida em PBS e homogeneizada pela passagem em seringa e agulha de diferentes calibres. Esse material foi aplicado por via subcutânea em vários pontos no dorso de coelho.
Após 30 e 45 dias de imunização, o soro do animal apresentou reatividade com a proteína recombinante purificada em reações de immunoblotting (Figura 12). O soro anti-gp70 recombinante mostrou títulos de 1:800 quando testado contra pequenas quantidades da proteína recombinante purificada (Figura 12). A partir desses resultados foi padronizado o uso do soro coletado 45 dias após a primeira imunização na diluição 1:200 para ensaios de immunoblotting.
Para a realização de alguns experimentos foi realizada a purificação de IgG total do coelho imunizado em coluna de proteína A, como descrito em Materiais e Métodos.
63 A B EcoRI SpeI +38 +795 PbMDJ1 parcial pHIS3 (5549pb) ori amp LacI T7 promotor EcoRI SpeI +38 +795 PbMDJ1 parcial EcoRI SpeI +38 +795 PbMDJ1 parcial pHIS3 (5549pb) ori amp LacI T7 promotor Pbgp70r (946 pb) +984 946 pb pHIS3 (5.549 pb) 1 2 3 4 5 6 850 1000 400 pb C 28 39 60 84 KDa 0 h 2h 4h 6h pHIS3 Ø pHIS3+inserto 0 h 2h 4h 6h
Figura 9 – Expressão da proteína Pbgp70 recombinante parcial. A – Representação esquemática do plasmídeo de expressão pHIS3 contendo o inserto o PbGP70 truncado (nt 38 a 984, oligoiniciados por Expr1/Expr3). B – Gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo, mostrando a digestão da construção pHIS3gp70 (colunas 2 a 6) com as enzimas EcoRI e SpeI. A banda de 946pb corresponde ao inserto. Coluna 1- Padrão de peso molecular 1Kb (Invitrogen). C
– Gel de poliacrilamida 12%, corado por Comassie blue, mostrando o perfil do extrato total de bactérias E. coli BL21pLysS contendo o vetor pHIS3gp70 (pHIS+inserto) ou o controle sem inserto (pHIS3 Ø), antes (0 h) e após indução com IPTG por 2 a 6 h. A proteína recombinante (massa aparente de 35 kDa) está indicada pela seta.
64 31 S I 2 h 4h 17 52 KDa S I
Figura 10 – Solubilidade da proteína Pbgp70 recombinante parcial. Gel de poliacrilamida 12%, corado com o corante Coomassie blue, apresentando o perfil dos lisados de bactérias (BL21pLysS) transformadas com o plasmídeo pHIS3gp70 após 2 e 4h de indução com IPTG (0,5mM). S, fração solúvel e I, fração insolúvel. A primeira coluna representa o padrão de massa molecular em kDa. A seta indica a proteína Pbgp70 recombinante.
31 17 52 KDa BSA 6, 3 5,9 5,9 4,5 4,5 4,5
Figura 11 - Purificação da Pbgp70 recombinante (seta, 35 kDa) em coluna Ni-NTA, a partir do extrato bruto de proteínas expressas em bactérias E. coli BL21pLysS, solubilizado em 8M de uréia. O extrato total de proteínas (Total), proteínas não ligantes (Não Ligados), proteínas eluídas pelos tampões com pH 6,3, 5,9 e 4,5, bem como a migração do padrão de peso molecular em kDa estão indicados.
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30 dias 45 dias
Anti-Pbgp70r
Figura 12 – Reações de immunoblotting da proteína recombinante purificada de 35 kDa frente as diluições 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800 dos soros de coelho obtido após 30 e 45 de imunização. A primeira coluna representa a reação como soro Pré-imune na diluição 1:50.
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4.3. Reatividade de Pbgp70 recombinante com soros de pacientes com