Expressão das proteínas da via do Sonic Hedgehog

As proteínas da via do HH foram avaliadas quanto à intensidade de reação e frequência de células marcadas nas amostras de MM, LMU, LMAU e LMSU. Inicialmente o escore (intensidade x frequência) dos marcadores foi dividido em negativo, fraco, moderado e forte, para a realização da analise

estatística. As amostras com expressão negativa foram excluídas e a frequência de amostras positivas (número de amostras com positividade moderada e forte) estão apresentadas na tabela 9. Os perfis de expressão geral das proteínas nos tecidos avaliados estão representados nas figuras 12- 15.

Tabela 09: Frequência de expressão das proteínas nos tecidos avaliados

Tecidos Proteínas (%)

SHH PTCH 1 SMO SUFU GLI 1# _{GLI 2}# _{GLI 3}# _{HHIP 1}#

MM 20 100* - - - 95 - 100

LMU 19 79 15 30 12,6 69 17 47

LMAU 37 75 37 50 56 62 37 43

LMSU 40 76 51 70 59 65 30 30

TOTALᵻ _{45 142 41 65 44 124 35 87}

*Somente expressão moderada de PTCH 1

# _{Somente expressão nuclear}

ᵻ _{Número absoluto de amostras positivas (moderado e forte)}

Figura 12: Perfil imunoistoquímico de SHH, PTCH 1, SUFU, SMO, GLI 1-3 e

HHIP 1 nas amostras de miométrio. O painel de fotomicrografia mostra exemplos somente de marcação moderada ou forte dessas proteínas nas amostras. Em A: SHH, B: PTCH 1, C: SUFU, D: SMO, E: GLI 1, F: GLI 2, G: GLI 3 e H: HHIP 1 em 400X. O gráfico apresenta os escores semiquantitativos de intensidade e frequência dos alvos nas amostras de MM. A linha pontilhada indica o valor indicado de corte (3), valores inferiores foram considerados como negativos nas análises de frequência.

Figura 13: Perfil imunoistoquímico de SHH, PTCH 1, SUFU, SMO, GLI 1-3 e

HHIP 1 nas amostras de leiomioma. O painel de fotomicrografia mostra exemplos somente de marcação moderada ou forte dessas proteínas nas amostras. Em A: SHH, B: PTCH 1, C: SUFU, D: SMO, E: GLI 1, F: GLI 2, G: GLI 3 e H: HHIP 1 em 400X. O gráfico apresenta os escores semiquantitativos de intensidade e frequência dos alvos nas amostras de LMU. A linha pontilhada indica o valor indicado de corte (3), valores inferiores foram considerados como negativos nas análises de frequência.

Figura 14: Perfil imunoistoquímico de SHH, PTCH 1, SUFU, SMO, GLI 1-3 e

HHIP 1 nas amostras de leiomioma não convencional. O painel de fotomicrografia mostra exemplos somente de marcação moderada ou forte dessas proteínas nas amostras. Em A: SHH, B: PTCH 1, C: SUFU, D: SMO, E: GLI 1, F: GLI 2, G: GLI 3 e H: HHIP 1 em 400X. O gráfico apresenta os escores semiquantitativos de intensidade e frequência dos alvos nas amostras de LMAU. A linha pontilhada indica o valor indicado de corte (3), valores inferiores foram considerados como negativos nas análises de frequência.

Figura 15: Perfil imunoistoquímico de SHH, PTCH 1, SUFU, SMO, GLI 1-3 e

HHIP 1 nas amostras de leiomiossarcoma. O painel de fotomicrografia mostra exemplos somente de marcação moderada ou forte dessas proteínas nas amostras. Em A: SHH, B: PTCH 1, C: SUFU, D: SMO, E: GLI 1, F: GLI 2, G: GLI 3 e H: HHIP 1 em 400X. O gráfico apresenta os escores semiquantitativos de intensidade e frequência dos alvos nas amostras de LMSU. A linha pontilhada indica o valor indicado de corte (3), valores inferiores foram considerados como negativos nas análises de frequência.

A figura 16 mostra as análises eststísticas considerando os marcadores com expressão moderada e forte (escore >3) nos diferentes tecidos. Não foi observada expressão significativa de SMO, SUFU, GLI 1 e GLI 3 nas amostras de MM. Por outro lado, 100% e 95% destas amostras mostrou expressão de PTCH 1 e GLI 2, respectivamente. HHIP 1 foi detectado em 100% das amostras de MM no núcleo e em 25% no citoplasma (Tabela 09 e Figuras 12 e 16).

Foi observada expressão positiva de PTCH 1 e GLI 2, em 79% e 69% das amostras de LMAU, respectivamente. SUFU e HHIP 1 apresentaram tanto marcação nuclear (12,6 e 6%) quanto citoplasmática (30 e 47%) no LMU (Tabela 09 e Figuras 13 e 16).

As amostras de LMAU mostraram alta frequência de expressão de PTCH 1 (75%), GLI 1 (56%) e GLI 2 (62%). SUFU e HHIP 1 mostraram expressão nuclear e citoplasmática (Tabela 9 e Figuras 14 e 16), porém com expressão nuclear predominante.

As amostras de LMSU, 76% e 70% foram positivas para PTCH 1 e SUFU, respectivamente. SHH e SMO foram detectados em 40% e 51% dos casos, enquanto os GLIs 1-3 foram observados em 59%, 65% e 30%, respectivamente (Tabela 9 e Figuras 15 e 16). Menor frequência de expressão de HHIP 1 foi detectada nestas amostras (40% no citoplasma e 30% no núcleo).

De modo geral as proteínas da via mostraram perfis crescentes, seja na intensidade da marcação (SMO, SUFU e GLI 3) ou na frequência de amostras positivas (SHH, SMO, SUFU, GLI 1, GLI 3), partindo do MM até os LMSU

(Figura 16). Somente as proteínas PTCH 1 e HHIP 1 mostraram padrão diferente ou invertido de expressão.

Figura 16: Representações gráficas dos escores semiquantitativos de

intensidade (I) e frequência (F) da marcação imunoistoquímica de SMO, SUFU, HHIP 1 e GLI 1-3 nos tecidos avaliados. Os asteriscos indicam diferenças significativas entre os grupos (p<0.05). As barras horizontais indicam significância estatística entre MM e todos os outros tecidos (LMU, LMAU e LMSU). A seta horizontal representa o valor de corte para a expressão negativa e fraca (IxF < 3). A seta vertical representa diferenças altamente significativas em relação aos outros grupos (p<0,0001).

Quanto às analises de correlação entre expressão proteica e os parâmetros clínicos, SHH mostrou expressão aumentada no MM (p=0.016) e LMU (p=0.039) de mulheres sem uso de contraceptivo oral. Além disso, menor

sobrevida livre de doença foi associada com a expressão de SHH e SUFU nos LMSU (Figura 17).

Figura 17: Curvas de Kaplan-Meier mostrando as taxas de sobrevida livre de

doença (meses) das pacientes com LMSU em relação à expressão protéica de SHH e SUFU.

Foi observado também que o aumento de expressão das proteínas GLIs foram associados a alguns parâmetros clínicos nos tumores. Nos LMU, a expressão de GLI 1 mostrou associação com o status menopausal das pacientes (p=0.031), GLI 2 com gravidez (p=0.046) e história de aborto espontâneo (p=0.027), e GLI 3 com aborto espontâneo (p=0.012). Nos LMSU o aumento de expressão de GLI 1 mostrou associação com o tamanho do tumor (>5 cm, p=0.031). Os dados referentes às análises realizadas estão apresentados na tabela 10.

Quanto à correlação entre expressão genica e protéica, foi observada para GLI 1 e HHIP 1 nos leiomiomas, PTCH 1 nos leiomiomas não convencionais e SUFU nos leiomiossarcomas. De modo geral, o perfil de expressão protéica corroborou os achados de expressão transcricional com perfil crescente dos marcadores, sendo que uma maior expressão de SMO, SUFU, GLI 1 e GLI 3 encontrados nos LMAU e LMSU.

Tabela 10: Correlação entre a expressão protéica com os dados clínicos patológicos

Dados clínicos Tecido

Frequência da expressão proteica e p valor

SHH _{PTCH 1 GLI 1 GLI 2 GLI 3}

Contraceptivo oral MM LM 93,3% n=14 87,2% n=41 p=0.01 p=0.03 0% n=0 6,4 n=3 p>0,05 100% n=15 100 n=49 p>0,05 22,4% n=11 0% n=0 p>0,05 86,5% n=45 100% n=16 p>0,05 Menopausa LM ULM LMS 100% n=4 0% n=0 50% n=7 p>0,05 25% n=1 0% n=0 14,3% n=2 p>0,05 100,0% n=4 0% n=0 35,7% n=5 p=0.02 50% n=2 0% n=0 35,7% n=5 p>0,05 50% n=2 0% n=0 64,3% n=9 p>0,05 Tamanho do tumor >5cm LM ULM LMS 0% n=0 50% n=1 47,6 % n=10 p>0,05 0% n=0 0% n=0 13,6% n=3 p>0,05 0% n=0 0% n=0 42,9% n=9 P=0.03 0% n=0 50% n=1 36,4% n=8 p>0,05 0% n=0 50% n=1 63,6 n=14 p>0,05 Tamanho do tumor ≤8cm LM ULM LMS 64,7% n=11 50% n=3 44,4% n=4 p>0,05 16,7 n=3 0% n=0 22,2% n=2 p>0,05 35,3% n=6 16,7% n=1 44,4% n=4 p>0,05 35,3% n=6 0% n=0 33,3% n=3 p>0,05 66,7% n=12 42,9% n=3 75% n=6 p>0,05 Aborto MM LM 14,3% n=2 0% n=0 p>0,05 23,1 n=3 0% n=0 p>0,05 0% n=0 0% n=0 p>0,05 69,2% n=9 80% n=14 p=0.02 6,7% n=10% n=0 p=0.01 Gravidez MM LM 6,7% n=3 0% n=0 p>0,05 22,2% n=10 0% n=0 p>0,05 0% n=0 0% n=0 p>0,05 72,2% n=14 42,6% n=20 p=0.04 0% n=0 2% n=1 p>0,05 Histerectomia MM LM 78,9% n=15 83% n=44 p>0,05 100% n=20 7,5% n=4 p>0,05 100% n=20 96,4 n=53 p>0,05 22,2% n=12 0% n=0 p>0,05 93,2% n=55 100% n=20 p=0.01 Patologias Associadas MM LM 23,1% n=3 12,2 n=6 p>0,05 100% n=14 75% n=39 p=0.02 0% n=0 2% n=1 p>0,05 43,1% n=22 28,6% n=4 p>0,05 10,7% n=6 0% n=0 p>0,05 SMO, SUFU e HHIP1 não apresentaram p valor significativo e foram excluídos da tabela .