Uma vez que detectamos diferenças na expressão de genes relacionados ao ciclo celular após super-expressão do miR-196a em diferentes períodos de tempo, o próximo passo foi verificar se também ocorreu diferença de expressão a nível proteico (Figura 14). Escolhemos para esta análise além da p27, as proteínas relacionadas à repressão do ciclo celular, p53 e p16.
A proteína p53 foi escolhida como ferramenta para avaliar o efeito indireto da super-expressão do miR-196a, uma vez que ela não é alvo desse miRNA. Além disso, o gene que codifica a proteína p53, TP53, estava mais expresso em células com maior expressão do miR-196a, principalmente 48 horas após a transfecção com esse miRNA (Figura 12).
Sendo o miR-196a responsável pela inibição de uma proteína repressora do ciclo celular (p27), esperava-se que a diminuição da proliferação celular encontrada em nossos estudos anteriores seria causada pelo aumento de expressão de outras proteínas repressoras do ciclo celular como resposta indireta à ação do miRNA. Esperava-se, portanto, um aumento na expressão, por exemplo, da proteína p53. Quando avaliamos a expressão gênica do gene que codifica essa proteína, TP53, encontramos uma maior expressão deste no grupo onde havia maior expressão miR-196a (Figura 13). Porém, quando avaliamos a expressão da proteína p53, não observamos alteração significativa na expressão após a super-expressão desse miRNA (Figura 14A). Houve uma variação entre a expressão em 24 horas e 48 horas. A detecção da proteína p53 pode ser feita através de anticorpos, método que utilizamos, porém, quando há mutação do tipo frameshift, geralmente essa proteína encontra-se ausente, quebrada ou instável, e por esse motivo é degradada rapidamente, podendo não ocorrer seu acúmulo ou mesmo detecção. O fato de não termos encontrado diferença na expressão proteica pode ter sido devido a essa mutação que é do tipo frameshift no gene que codifica essa proteína, a qual é descrita na linhagem utilizada (NICHOLS et al., 2014; OBATA et al., 2000).
Além da p53, a p16 também foi escolhida por ser uma proteína repressora do ciclo celular e que poderia sofrer efeitos indiretos da super-expressão do miR-196a. Nesse trabalho nós não conseguimos detectar a expressão do gene CDKN2A, que codifica a p16, por PCR em tempo real no grupo controle nem no grupo transfectado com o miR-196a. Porém conseguimos detectar a proteína p16 por western blot
(Figura 14B). Não houve diferença significativa na expressão de p16 quando havia maior expressão do miR-196a nas células (Figura 14B). Existem algumas controvérsias em relação a uma mutação do tipo perda no número de cópias, presente nesse gene em linhagens de SCC-25. Em trabalho descrito por Lee et al. (2004), os autores encontraram uma mutação homozigota para esse gene, resultado este diferente dos encontrado por Martin et al. (2014), o qual não identificou nenhum tipo de mutação em CDKN2A nessa linhagem. Nós pudemos observar também que quando comparamos o nível de expressão de p16 de queratinócitos orais normais, em condições de cultivo celular semelhantes às SCC-25 no período de 72 horas, havia maior expressão dessa proteína em queratinócitos orais normais (Figura 14B), indicando que provavelmente exista essa mutação do tipo perda do número de cópias em células SCC-25 utilizadas nesse estudo (Figura 14B).
Por ser alvo do miR-196a, esperava-se que após a super-expressão deste, a proteína p27 tivesse sua expressão diminuída. Observamos que essa diminuição proteica ocorreu 48 e 72 horas após a super-expressão do miR-196a em relação ao controle que não recebeu miR-196a (Figura 14C). Notamos também que a expressão da proteína p27 aumentou do longo do tempo independentemente do tratamento (Figura 14C). Embora o miR-196a tenha diminuído significativamente a expressão da proteína p27 nos períodos de 48 e 72 horas, o nível de proteína no grupo com maior expressão do miR-196a nesses períodos foi maior do que o período de 24 horas, tanto do controle quanto do grupo transfectado. Em relação à expressão gênica notamos que a expressão de CDKN1B, gene alvo do miR-196a e que codifica a p27, estava maior no período de 48 horas em relação ao período de 24 horas, independentemente do tratamento. Diferente do que ocorreu com a expressão de p27, a expressão de CDKN1B aumentou cerca de 9 vezes 48 horas após a super-expressão do miR-196a em relação ao controle, porém como os miRNAs atuam sobre os RNAm, a diferença entre a expressão gênica e a proteica pode de fato ocorrer. Hou et al. (2014) e Sun et al. (2012) também encontraram que quando há super-expressão de miR196a, ocorre a diminuição de p27.
Em trabalho realizado por Schwanhäusser et al. (2011), os autores demonstram que a abundância proteica celular é predominantemente controlada a nível de tradução. Eles observaram que os níveis celulares de proteínas principalmente dependem da tradução do RNAm no citoplasma, e destacam que são os ribossomos que determinam a abundância proteica. Ao contrário do que ocorre
com RNAm e proteínas de genes “housekeeping”, os quais são estáveis, proteínas responsáveis por processos de sinalização rápidos são geralmente instáveis, como o caso das proteínas envolvidas em ciclo celular. As células podem rapidamente se adaptar às mudanças em seu ambiente. Isto também explica porque as etapas decisivas ocorrem no citoplasma e não no núcleo, pois isso permite que a célula responda dinamicamente ao ambiente.
Figura 14. Expressão proteica por Western Blot e análise de densitometria por Image J após super- expressão do miR-196a em linhagem SCC-25. A) Expressão de p53 24, 48 e 72 horas após a super- expressão do miR-196a; B) Expressão de p27 24, 48 e 72 horas após a super-expressão do miR- 196a; C) Expressão de p16 24, 48 e 72 horas após a super-expressão do miR-196a. Não houve diferença significativa na expressão de p53 comparado ao controle; Redução na expressão de p27 após super-expressão de 196a; Não houve diferença na expressão de p16. (*** p<0,0005; **** p<0,0001) (ANOVA, pós teste Sidak).
p53 p27 β-actina β-actina A C p16 β-actina B Queratinócitos orais normais
5 DISCUSSÃO
Identificamos anteriormente que a expressão do miR-196a era mais elevada em CECP, tanto em tecido tumoral quanto em linhagens celulares derivadas de CECP, quando comparado ao tecido livre de tumor ou queratinócitos orais normais (ANDREGHETTO et al., 2011; SEVERINO et al., 2013). Na literatura o papel desse miRNA não é bem estabelecido (HOU et al., 2014; KIM et al., 2009; SAITO et al., 2013; SCHIMANSKI et al., 2009; SUN et al., 2012). Desse modo, avaliamos o efeito da super-expressão do miR-196a em queratinócitos orais normais, uma vez que esse miRNA é mais expresso no tumor, imaginou-se que seu efeito seria promover proliferação celular, mas seu efeito foi ao contrário do que imaginou-se (SEVERINO et al., 2013). Como se não bastasse, quando a super-expressão do miR-196a foi analisada em uma linhagem celular derivada de CECP, SCC-25, também foi contatado menor proliferação celular (ANDREGHETTO, 2011). Em trabalhos anteriores, os ensaios de proliferação para avaliar os efeitos do miR-196a foram realizados 72 horas após a sua super-expressão, nesse trabalho, avaliamos qual era a função desse miRNA no período anterior a 72 horas.
A SCC-25 foi escolhida para realização dos ensaios de super-expressão do miR-196a, pois como já foi dito, em trabalho anterior, essa linhagem apresentou diminuição da proliferação celular 72 horas após a super-expressão desse miRNA. Além disso, nesse trabalho realizamos a sincronização do ciclo celular através da privação de SFB por 48 horas, para avaliarmos mais detalhadamente o efeito do miR-196a durante a divisão celular, e a linhagem SCC-25 foi a linhagem que apresentou melhor sincronização do ciclo celular em relação as outras linhagens testadas, SCC-9 e FaDu.
Após definido o modelo celular a ser utilizado, realizamos a super-expressão do miR-196a através de duas técnicas, por transdução com lentivirus e por transfecção com lipossomos. A vantagem da transdução com lentivírus é que a super-expressão do miR-196a se manteria estável e poderíamos selecionar somente os clones transduzidos para futuros ensaios, mas interessantemente não houve proliferação nas células transduzidas com o miR-196a, como houve no controle e por esse motivo não conseguimos expandir a cultura para ensaios futuros. Este resultado poderia estar relacionado ao efeito direto do miRNA sobre a proliferação da linhagem, poderia ser considerado um efeito off-target do miR-196a ou ainda um
efeito da técnica sobre a proliferação celular. O segundo tipo de efeito parece ter sido o ocorrido, de acordo com discussões entre nosso grupo e o fabricante dos vetores (comunicação pessoal), mas não avaliamos esta hipótese através da transdução de outros miRNAs e portanto não é possível concluir.
Embora a técnica de super-expressão por transfecção com lipossomo seja transiente, a expressão do miR-196a se manteve alta em todos os períodos avaliados e pudemos avaliar os efeitos da super-expressão do miR-196a no período de tempo desejado. Além disso, conseguimos fazer com que o nível de expressão do miR-196a em células transfectadas com relação ao controle fosse semelhante à relação da expressão no tumor pelo tecido não tumoral observada em estudo anterior (SEVERINO et al., 2013).
Depois de estabelecido o método de super-expressão do miR-196a na linhagens SCC-25, avaliamos os efeitos desse miRNA sobre a expressão de genes relacionados ao ciclo celular nos períodos de 4, 12, 24 e 48 horas após a transfecção. Após a análise dos resultados acreditamos que embora a expressão do miR-196a tenha aumentado a expressão de diversos genes ativadores do ciclo celular, ele também promoveu o aumento da expressão de genes que são repressores do ciclo, como por exemplo, genes que fazem parte do checkpoints, com isso, por mais que o ciclo celular seja ativado, as células que estão em divisão, pois não conseguem passar facilmente pelos checkpoints.
Em reposta a perturbações celulares, como por exemplo, estresse oxidativo, erro no DNA, os checkpoints inibidores são ativados. Dentre esses reguladores do
checkpoint, incluem-se genes de resposta a erros no DNA, como ATM, ATR, HUS1,
RAD1, RAD9, p53, membros da família de inibidores de CDK, p15 (CDKN2B), p16 (CDKN2A), p21 (CDKN1A) e p27 (CDKN1B). Além desse, a família de proteínas MAD que são responsáveis pela separação dos cromossomos na divisão celular (SARFRAZ et al., 2009).
Em dois trabalhos, Alcorta et al. (1996) e no de Leontieva e Blagosklonny (2013), é relatado que p21 e p16 induzem a senescência por inibir CDK4/6 e quando isso acontece aumenta a expressão de Ciclina D1, nesse trabalho observamos maior expressão do gene CDKN1A (p21), principalmente em 12 e 48 horas após a super-expressão do miR-196a em relação ao controle (Figura 14C e 14G), também observamos que havia expressão da proteína p16 em 24, 48 e 72 horas após a super-expressão do miR-196a (Figura 15B), além disso, a Ciclina D1 estava mais
expressa em quase todos os períodos de análise (4, 24 e 48 horas), mas o maior pico de expressão em relação ao controle foi em 48 horas (Figura 14G). Esse talvez seja um dos mecanismos pelo qual houve menor proliferação nas células com maior expressão do miR-196a em estudo anterior onde avaliamos a expressão 72 horas após a transfecção porém, para ser confirmada essa hipótese outros ensaios deveriam ser realizados, como por exemplo, mostras a ativação dessas proteínas através da fosforilação.
A expressão do gene CDKN1B estava 9 vezes mais expresso nas células que super-expressava o miR-196a, 48 horas após a transfecção, porém, a expressão de p27 estava menor nessas células, o que é totalmente aceitável uma vez que esse miRNA tem como alvo o gene CDKN1B, inibindo assim a tradução de p27. Curiosamente, a análise da PCR mostrou que o gene CDKN1B estava mais expresso no período de 48 horas em relação ao período de 24 horas, independentemente do tratamento, resultado esse que também foi observado na expressão proteica, ou seja, o aumento da expressão gênica está diretamente relacionado ao aumento da expressão proteica. Dessa forma, podemos levantar a hipótese de que se o miR-196a não tivesse como alvo o gene CDKN1B, no período de 48 horas após a transfecção, que esse gene estava 9 vezes mais expresso do que no controle, a expressão de p27 também estaria maior. Isso nos leva a inferir que pode ser muito provável que os outros que estavam mais expressos nas células com maior expressão do miR-196a em relação ao controle no período de 48 horas, como os genes repressores do ciclo celular, também estejam com maior nível de expressão proteica do que o controle, uma vez que o miR-196a não tem como alvo esses outros genes para inibir a tradução, como fez com a p27.
No trabalho de Litovchick et al. (2007), os autores relatam um complexo de proteínas com múltiplas subunidades e que é evolutivamente conservada, umas dessas subunidades são p130 e E2F4, e esses complexos reprimem o ciclo celular através de genes relacionados à quiescência. Interessantemente, esses dois genes p130 (RBL2) e E2F4, estão mais expressos no período de 48 horas após a super- expressão do miR-196a. Eles também observaram que o nível de expressão das Ciclinas A, E1 e CDK2 aumentaram na fase S, resultado que também observamos 48 horas após a transfecção com o miR-196a em relação ao controle, nos ensaios de expressão gênica (Figura 13H). Isso nos leva a inferir que esse também pode ser um mecanismo pelo qual o miR-196a possa interferir na proliferação celular. Mas
para essa hipótese ser confirmada, o nível de expressão dessas proteínas deveria ter sido mensurado juntamente com a expressão dos genes relacionados à quiescência.
A expressão gênica das células SCC-25 que foram submetidas à super- expressão do miR-196a nos revelou que embora diversos genes relacionados à progressão do ciclo celular tenham aumentado a expressão, genes com o efeito de repressão do ciclo celular também tiveram sua expressão alterada. Isso nos leva a inferir que de alguma maneira a alteração da expressão desses genes resultou na estabilidade ou equilíbrio do ciclo celular, pois através de ensaios de ciclo celular com iodeto de propídeo, nós não observamos diferença do percentual de células nas diferentes fases do ciclo celular, quando comparamos ao controle.
Novos estudos são necessários para validar esses resultados em outras linhagens celulares derivadas de CECP. Além disso, estudos envolvendo a analise da expressão das proteínas que são codificadas pelos genes que foram desregulados pelo aumento de expressão do miR-196a, também são necessários.
6 CONCLUSÃO
1 – Utilizamos com sucesso a privação de SFB por 48 horas como método para a sincronização do ciclo celular das linhagens derivadas de CECP e avaliamos a dinâmica de crescimento após a privação de SFB. Observamos que a linhagem SCC25 foi a que melhor respondeu tanto à sincronização do ciclo celular como à introdução do soro para reestabelecimento do crescimento.
2 – Padronizamos os experimentos de transdução e transfecção para super- expressão do miRNA 196a. A parada da proliferação das células transduzindas com miR-196 foi inesperada e portanto optamos por utilizar a transfecção como método para este estudo.
3 – Avaliamos o efeito do miR-196a sobre a expressão de genes e proteínas relacionados com o ciclo celular. Ao realizarmos a super-expressão do miR-196a na linhagem SCC-25, conseguimos observar uma desregulação da expressão de genes ativadores e de genes repressores do ciclo celular. Além disso, também notamos que a maior expressão do miR-196a diminuiu os níveis da proteína p27, repressora do ciclo celular, mas não houve interferência na porcentagem de células nas diferentes fases do ciclo em relação ao controle.
Concluímos que o aumento de expressão de genes que estão relacionados à repressão do ciclo celular, principalmente no período de 48 horas após o aumento da expressão do miR-196a, foi provavelmente o suficiente para diminuir a proliferação celular no período de 72 horas após sua super-expressão, resultado encontrado em trabalho anterior. Desse modo, acreditamos que o miR-196a poderia ser usado como alvo de terapia, uma vez que reduziu a proliferação em células tumorais, mesmo já estando mais expresso nessas células.
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