Expressão e purificação de produtos de genes do metabolismo intermediário de Xylella

Dihidrolipoamida desidrogenase (Lpd e LpdA)

Após a inserção de pET15b/lpd em linhagem BL21(DE3) de E. coli, foram realizados testes de expressão (indução por 1 mM de IPTG por 3 horas à 37C) seguido de purificação em gel SDS-PAGE redutor (Figura 20).

Figura 20. Presença de Lpd recombinante em corpo de inclusão.

Lisado celular de E. coli BL21(DE3) assim como etapas de purificação estão descritos na seção “Materiais e Métodos”. Raia 1. Bench Mark®

ladder; 2. Fração purificada; 3-4. Frações eluídas com 20 e 50 mM de Imidazole respectivamente; 5. Fração correspondente as proteínas precipitadas.

Lpd recombinante não estava presente na fração eluída (Raia 2) nem nas lavagens anteriores (Raias 3-4), mas sim no precipitado celular (Raia 5) obtido após as etapas de lise celular por sonicação, mostrando que Lpd estava presente em grandes quantidades em corpos de inclusão. Corpos de inclusão são agregados protéicos inativos presentes na forma insolúvel. Sabe-se que muitas proteínas quando superexpressas em E. coli vão para corpos de inclusão devido às altas concentrações (chegando à escala de milimolar)

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presentes no citossol durante a etapa de indução. Além disso, muitas proteínas para se manterem na forma solúvel necessitam de pontes dissulfeto estáveis para se enovelar corretamente em uma conformação nativa. Essas condições são dificultadas devido ao alto potencial redutor do compartimento citossólico.

Em uma primeira etapa, Lpd foi purificada dos corpos de inclusão (Figura 21), porém não conseguimos renaturá-la apropriadamente.

Figura 21. Purificação de Lpd recombinante de corpos de inclusão.

Amostra foi corrida em gel SDS-PAGE redutor. Raia 1. Bench Mark® ladder; 2. Fração purificada.

Sabe-se que diminuir a temperatura durante a etapa de indução (Schein & Noteborn, 1989) assim como diminuir as concentrações do agente indutor (neste caso IPTG) pode levar a uma maior quantidade de proteína solúvel. Entretanto, não conseguimos Lpd no extrato solúvel após tentativa de indução à 20C overnight com metade da concentração de IPTG (0.5 mM) utilizada em condições normais. Dessa maneira, transformamos as linhagens AD494(DE3) e Origami(DE3) com o vetor pET-15b/lpd. Essas linhagens possuem deleções em genes com atividade dissulfeto redutase(trxB em AD494; trxB e gor em Origami), diminuindo assim o potencial redox do citossol facilitando assim a formação de pontes dissulfeto. Aliando essa estratégia, em conjunto com indução overnight à 20C, conseguimos obter Lpd solúvel em altas quantidades, principalmente na linhagem AD494 (Figura 22).

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Figura 22. Purificação de Lpd solúvel em linhagem AD494(DE3).

Amostra foi corrida em gel SDS-PAGE redutor. Raia 1. Bench Mark® ladder; 2. Fração purificada.

O vetor pET-15b/lpdA foi transformado em linhagem AD494(DE3) e os transformantes foram primeiramente induzidos à 20C para garantir produção de enzima na fração solúvel celular (Figura 23).

Figura 23. Purificação de LpdA solúvel em linhagem AD494(DE3).

Amostras foram corridas em gel SDS-PAGE redutor. Raia 1. Bench Mark® ladder; 2-6. Frações purificadas.

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Dihidrolipoamida aciltransferase (SucB e PDHB)

SucB e PDHB foram anotadas no banco de dados do genoma de X. fastidiosa (www.xylella.lncc.br) como os componentes E2 (com atividade dihidrolipoamida aciltransferase) dos complexos da α-cetoglutarato e piruvato desidrogenase respectivamente,

Não foi possível clonar sucB em pET-15b pois o gene possui sítios de restrição para as enzimas NdeI e BamHI, únicos sítios de restrição disponíveis em pET-15b para clonagem. Dessa maneira, sucB foi clonado no vetor pET-28a que possui uma maior variedade de sítios de restrição para clonagem. Esse vetor, tem marca de seleção para o antibiótico canamicina, não sendo compatível com as linhagens AD494 ou Origami. Análise da seqüência primária de aminoácidos de SucB mostrou que essa enzima não possui cisteínas, portanto, sem necessidade da formação de pontes dissulfeto para garantir a solubilidade da proteína. Portanto, o vetor pET-28a/sucB foi transformado em linhagem BL21(DE3) e os transformantes foram submetidos a expressão e purificados com alto grau de pureza (Figura 24).

Figura 24. Purificação de SucB solúvel em linhagem BL21(DE3).

Amostras foram corridas em gel SDS-PAGE redutor. Raia 1. Bench Mark® ladder; 2. Fração eluída 100mM Imidazole; 3-10. Frações purificadas.

PDHB, ao contrário, possui cisteínas em sua estrutura primária. Sendo assim, clonamos a construção pET-15b/pdhB em AD494(DE3) conseguindo assim expressar PDHB na forma solúvel permitindo sua purificação com alto grau de pureza (Figura 25).

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Figura 25. Purificação de PDHB solúvel em linhagem AD494(DE3).

Amostras foram corridas em gel SDS-PAGE redutor. Raia 1. Bench Mark® ladder; 2-9. Frações purificadas.

Análises in silico utilizando o PROSITE, um banco de dados da ExPASy (http://ca.expasy.org) para domínios, famílias e sítios funcionais de proteínas, mostrou que SucB e PDHB possuem domínios de ligação a ácido lipóico (um em SucB e dois em PDHB). Curiosamente, foi encontrado na porção N-terminal de LpdA de Xylella fastidiosa, um domínio de ligação a ácido lipóico além do domínio de ligação a flavina e as cisteínas do centro redox. Em Streptococcus pneumoniae, foi encontrado uma dihidrolipoamida desidrogenase (também denominada LpdA) com um domínio de ligação a ácido lipóico N- terminal, e foi mostrado nesse trabalho que esse domínio era funcional (Håkansson et al., 2007). Portanto, enzimas LpdA são dihidrolipoamida desidrogenases que também abrigam seu produto: lipoamida.

Como visto anteriormente, a reação de incorporação do ácido lipóico ou do seu precursor no resíduo de lisina de enzimas alvos é um processo enzimático de várias etapas. Visto que as enzimas necessárias nesse processo não são superexpressas, elas se tornam passo limitante da reação. Portanto, para garantir lipoilação completa, suplementamos linhagens de E. coli superexpressando LpdA, SucB e PDHB com ácido lipóico (300 g/ml) durante a etapa de indução em baixa temperatura (20ºC) e com baixas concentrações de IPTG (0.1 mM), proporcionando uma expressão mais lenta e, garantindo assim, incorporação total de ácido lipóico nas enzimas pela enzima lipoato ligase (LplA) de E. coli.

4.2.2. Expressão e purificação de produtos de genes do sistema tiorredoxina

No documento Caracterização funcional de uma nova proteína antioxidante: Ohr (Organic Hydroperoxide Resistance Protein). Vias de redução e expressão em Xylella fastidiosa (páginas 74-78)